8.2.3 外泌体工程化-内源性装载-内部蛋白装载

在培养皿进行外泌体供体细胞铺板，使用与细胞兼容的培养基，24小时后达到70-80%的融合度，并确保使用无外泌体胎牛血清培养基，将细胞放回培养箱进行培养。
24小时后，将XPack载体与所选择的转染试剂混合，按照适当的方案实现细胞的转染。
具体步骤如下（以SBI的转染试剂PureFection 货号LV750A-1为例）
a. 将5 uL转染试剂、2.5 ug XPack慢病毒载体和200 uL无血清培养基混合在1.5 mL离心管中
b. 短暂的漩涡，并在室温下孵育15分钟
c. 将全部体积加入到6孔板中，每个孔总体积为2-3 mL的培养基
24小时后换液
在转染后48-96小时内分离纯化外泌体

XPack外泌体的分离及添加到目的细胞中
1.    取出细胞培养基，转移到15 mL或50 mL的离心管中 
2.    在1：5体积的细胞培养基中加入ExoQuick-TC
3.    倒置混合，在4°C下孵育过夜
4.    在室温或4°C下，以3000xg旋转离心管30分钟（温度不影响外泌体产量）。弃上清液，在100 uL PBS中重悬含外泌体
5.    在Nanodrop上使用A280测量外泌体的产率。调整浓度至1 μg/μL
6.    将外泌体加入到含有目标细胞的细胞培养皿中

1.    XPack MCS有以下序列，限制性内切酶位点（XhoI、BamHI、NotI、EcoRI、NheI和PstI）以粗体和下划线表示：
 

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2、XPack标签在DNA序列水平上长32个的核苷酸，因此需要在ORF的5‘端添加1个核苷酸来生成frame fusion。然后，计算从MCS中初始密码子的第一个核苷酸到插入ORF结束的核苷酸的数量，并根据需要添加尽可能多的核苷酸，使数量为3的倍数。在这个数字上加1个核苷酸（生成一个in frame XPack标签），并将核苷酸的数量添加到5‘酶位点引物和ORF序列之间
3.确保任何添加的核苷酸都不会产生一个过早的终止密码子
以EcoRI 为例
从MCS开始到EcoRI位点的核苷酸数量：32
添加1个核苷酸：33个核苷酸，3的倍数
添加1个核苷酸使XPack fusion in frame
添加两个核苷酸（X）到上游PCR引物，位于EcoRI 位点和ORF priming 序列之间：5’-GAATTC-XX-ORF site

1.    将XPack质粒转染到HEK293T（或等效的）产生细胞中
a)    转染前18 - 24小时，在每150mm细胞培养板中，细胞铺板（7.0-8.0x106 293T细胞），放置在培养基中，不加抗生素。到第二天，细胞的~应为80%的融合
b)    在转染当天，通过移液将LentiStarter 2.0 Kit 试剂盒中提供的45µl pPACKH1包装质粒和4.5µg XPack慢载体混合在1.6 ml无血清DMEM中
c)    在同一试管中加入55µL纯液。涡旋10秒
d)    在室温下孵育混合物15分钟。
e)    将混合物滴加入培养皿中，旋转均匀地分散在整个培养皿中
f)    转染后12小时（或第二天）换液
g)    在转染后48小时和72小时，将培养基（现在含有假病毒颗粒）收集到一个50ml无菌的、带盖的锥形离心管中。在室温下以3000 x g离心15分钟，使细胞碎片成颗粒。将病毒上清液转移到一个新的试管中
h)    浓缩假病毒颗粒

图 15 产生高滴度慢病毒颗粒的工作流程
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