1.1.1 瞬时沉默-siRNA

瞬离siRNA管，以确保siRNA冻干粉沉在管底。用无RNA酶的1x siRNA Buffer或水重悬，例，加500μL 1x siRNA Buffer至10nmol siRNA管中，配制成20μM母液浓度

瞬离后用紫外分光光度计验证siRNA浓度。(siRNA:1μM=13.3ng/μL)

siRNA溶解后可直接使用，也可等分成更小体积限制冻融次数，-20℃保存

最佳细胞密度随生长特性不同而不同，每一种细胞类型需要经验确定。以96孔板DLD-1细胞铺板为例， 5x10³个细胞/孔，100μL/孔，37℃过夜培养

a.  用无RNA酶的1x siRNA Buffer或水将母液稀释至5μM
b.  在管1中加入9.5μL无血清培养基，0.5μL 5μM siRNA至总体积10μL
c.  在管2中加入9.5-9.95μL无血清培养基，0.05-0.5μL转染试剂(此处以DharmaFECT reagent为例)至总体积10μL
d.  轻轻吹打管1和管2，混匀，室温孵育5min
e.  将管1内容物添加至管2中，总体积20μL, 上下颠倒几次混匀，室温孵育20min
f.   加入80μL不含抗生素的完全培养基，至总体积100μL
g.  弃除细胞板中的培养基，加入100μL配置好的转染复合物
h.  37℃，5%CO₂中培养24-48h，qPCR检测mRNA水平敲低
i.   48-96h，WB检测蛋白水平敲低

为获取最佳实验结果，转染前后细胞活力需>80%，如果有必要，可在转染24小时后更换培养基降低细胞毒性，继续孵育24-72h进行检测

Q1: 多久可以更换培养基，转染持续时间是多久？
A1: 培养基可以再转染6h后进行更换，但这不是必需的，整个转染过程是在6h内完成的，基因沉默检测应该在24h后

Q2: 为什么使用无抗生素的培养基是必要的？
A2: 推荐整个转染过程中避免使用抗生素，原因是细胞在转染的过程中非常敏感，抗生素会增加细胞死亡。如果必须添加抗生素，也推荐在转染6h后更换含有抗生素的新鲜培养基

Q3: 转染时siRNA的浓度？
A3: 由于靶基因的内在特性，不同siRNA的最佳siRNA量可能不同。推荐使用siRNA浓度曲线，范围在5-100nM，找到每个siRNA对应发挥最佳沉默效果的最低使用浓度