1.1.3  稳定沉默-shRNA

a.  解冻甘油菌原液
b.  取甘油菌原液10μL接终至LB肉汤中(含羧苄100μg/mL)，37℃摇床震荡18-19h
c.  使用质粒提取试剂盒提取高纯度质粒(QIAGEN Cat 12362)
d.  取0.2-1μg质粒跑胶鉴定，pGIPZ shRNA条带大小在11774bp

以下使用的限制性内切酶均来自Absin，KpnI (abs60220)， SalI(abs60234)，XhoI(abs60243)，NotI(abs60226)

a.  将下表组分按所述顺序添加到无菌PCR管壁，轻轻混合
b.  37℃孵育5min，跑胶

以24孔板为例

a.  贴壁细胞：每孔铺~5*10⁴个细胞；悬浮细胞：每孔铺~5*10⁵个细胞
b.  将1μg DNA稀释于50μL DMEM或其他无血清生长培养基中
c.  轻轻混匀转染试剂(这里以DharmaFECT kb为例)，取3μL转染试剂加入稀释好的DNA中形成转染复合物，轻轻吹打均匀
d.  室温孵育10min
e.  弃除培养基，换成0.45mL新鲜完全培养基
f.   每孔添加50μL混合好的转染复合物，轻轻混合均匀
g.  37℃培养
h.  转基因表达分析：转染24-48h
i.   稳定转染：细胞需在选择性培养基中生长10-15天

确定抗生素剂量反应情况(致死曲线)。为了产生稳定表达的细胞系，确定杀死未转染细胞所需的最低抗生素量是重要的一步

a.  Day 1：使用相同的细胞类型和相对细胞密度用于随后的转染或转导，铺细胞、培养过夜
b.  Day 2：将完全培养基替换为添加一定浓度(0~15 μg/mL)的嘌呤霉素培养基，包括未添加抗生素的未处理对照细胞
c.  Day 3：更换培养基，测定细胞活力
d.  根据细胞生长情况，每2-3天更换培养基为含嘌呤霉素的新鲜培养基
e.  添加嘌呤霉素后3-6天，每天检查细胞，确定有效杀死所有未转染/转导细胞之间的抗生素的最低浓度

pGIPZ载体是tat依赖的，所以必须使用可表达tat基因的慢病毒包装系统，推荐使用Dharmacon Trans-Lentiviral shRNA Packaging Kit(Cat #TLP5912 or TLP5917)

a.  转导前一天，进行24孔板铺板，每孔添加5*10⁴个HEK293T细胞(DMEM, 10%胎牛血清，pen-strep 1%)
b.  用无血清培养基在96孔板(圆底)中稀释病毒原液。如图所示，目的是生产一系列5倍稀释，最终稀释达到390,625倍

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c.  每孔加入80μL无血清培养基
d.  第一列中加入解冻的病毒原液，轻轻吹打混匀
e.  更换新的枪头，从第一列中吸取20μL溶液进入第二列
f.   更换新的枪头，从第二列中吸取20μL溶液进入第三列
g.  重复上述步骤直至第八列，每次吹打10-15次，更换枪头
h.  如图，每一行标记好病毒原液名称

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i.  去除板24孔板中的细胞培养基
j.  每孔添加225μL无血清培养基
k.  将稀释好的病毒溶液添加至细胞培养板中，每孔25μL
l.   37℃培养4h
m. 弃除转导混合物，重新添加1mL DMEM(10%胎牛血清，pen-strep 1%)
n.  继续培养48h细胞
o.  计数表达绿色荧光的细胞或细胞集落，如图

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p.  可使用如下公式计算每毫升的转导单位(TU/mL)：# of TurboGFP positive colonies counted×dilution factor×40 =#TU/mL
q.  MOI确定: 许多因素可能会影响最佳MOI的确定，包括哺乳动物细胞的性质(主动分裂与非分裂)、其转导效率、应用方向以及靶向基因的性质。如果您是第一次将慢病毒载体转导到所选择的哺乳动物细胞系中，在对慢病毒颗粒进行滴定后，我们建议使用一系列MOI(例如，0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20)来确定为您的特定应用获得最佳表达所需的MOI。需要注意的是，要实现单拷贝敲低，通常使用MOI为0.3，因为只有不到4%的细胞会有多个插入。

以慢病毒转导至HEK293T, OVCAR-8, MCF细胞，24孔板，无血清培养基为例

a. 第0天，24孔板中每孔铺板5*10⁴个细胞，完全培养基，培养过夜
b. 第1天，弃除培养基并添加适量的病毒，以达到您希望使用的MOI，以同样的方式设置所有所需的实验和对照
c. 转导后大约4-6小时，再加入1mL完全培养基到细胞中，孵育一夜
d. 在转导后48小时，在显微镜下检查细胞是否存在报告基因(TurboGFP)的表达
e. 如果添加嘌呤霉素，根据致死曲线选择适当的浓度，用选择的培养基培养细胞
f.  大约每2-3天更换新鲜制备的选择性培养基
g. 每天监测细胞，观察存活细胞的百分比，一旦未转导的对照细胞死亡，转导孔中存活的细胞将表达shRNA。选择嘌呤霉素的最佳效果应在4-6天内达到，这取决于从致死曲线中选择的嘌呤霉素浓度
h. 一旦您的转导效率达到可接受的水平，就可以通过RT-qPCR、Western blot或其他适当的功能检测实验来检测细胞基因表达或荧光报告活性的降低。将目的基因与未处理的、单独报告基因(空载体)、非沉默shRNA或其他阴性对照进行比较

Q1:可以在哪里知道shRNA构建子的序列？
A1:可直接在Horizon Discovery官网上检索基因ID，找到对应的shRNA，
即可找到对应货号的shRNA序列信息

Q2:使用的抗生素类型是？
A2:shRNA构建子扩增过程中需使用：含25μg/mL zeocin和100 μg/mL 
Carbenicillin的2xLB培养基

Q3:pGIPZ质粒载体的测序引物序列是？
A3:5' - GCATTAAAGCAGCGTATC - 3'