1.2.1 瞬时敲除-Synthetic crRNA

瞬离crRNA, SAM tracrRNA，确保RNA干粉沉于管底，使用nuclease-free 10mM Tris -HCl Buffer pH7.4.(Cat #B-006000-100)进行溶解。例如，将10nmol crRNA溶解至1000μL 10mM Tris -HCl Buffer pH 7.4中，至储存浓度为10μM。轻轻吹打混匀，避免气泡生成

瞬离后用紫外分光光度计验证crRNA浓度。(crRNA:1μM=13.5ng/μL; SAM tracrRNA, 1μM=33.5ng/μL）

siRNA溶解后可直接使用，也可等分成更小体积限制冻融次数，-20℃保存

以96孔板，Cas9蛋白+crRNA+tracrRNA化学共转染为例

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a.  第一天进行细胞铺板，确保第二天转染时细胞融合度在70-90%左右
b.  crRNA和cas9工作浓度配制：
crRNA+tracrRNA，使用nuclease-free 10mM Tris -HCl Buffer pH7.4稀释至2.5μM工作浓度；Cas9蛋白，使用无血清培养基稀释至2.5μM工作浓度
c.  转染复合物制备：以单孔为例。管1中添加2.5μL 2.5μM crRNA+tracrRNA ，1μL 2.5μM Cas9蛋白，加无血清培养基补足至50μL；管2中加入0.1-0.8μL DharmaFECT Duo，加无血清培养基补足至50μL。室温孵育5min，将管1和管2混合，轻轻吹打均匀
d.  转染：弃除板孔中的培养基，每孔加入100μL的转染复合物
e.  转染14-18h后，用新鲜完全培养基替换转染复合物

Q1: sgRNA，crRNA,  tracrRNA, SAM tracrRNA平均分子质量是多少？
A1: sgRNA=32,327g/mol; crRNA=13,500g/mol; tacrRNA=23,759g/mol; 
SAM tracrRNA=33,460.0g/mol

Q2: sgRNA, crRNA, tracrRNA, SAM tracrRNA怎么进行nmol和μg的换算？
A2: 以crRNA为例: (5nmol)(13,500g/mol)(mol/10⁹nmol)(10⁶µg/g)=67.5µg