1.2.3  稳定敲除-Lentiviral sgRNA

a.  解冻甘油菌原液
b.  取甘油菌原液10μL接种至LB肉汤中(含羧苄100μg/mL)，37℃摇床震荡18-19h
c.  使用质粒提取试剂盒提取高纯度质粒(QIAGEN Cat 12362)

以24孔板为例

a.  转染前24h细胞铺板：贴壁细胞——每孔铺~5*10⁴个细胞；悬浮细胞——每孔铺~5*10⁵个细胞
b.  将0.5μg Edit-R Lentiviral sgRNA质粒和0.5μg Cas9 Nuclease质粒(共1μg质粒)稀释于50μL DMEM或其他无血清生长培养基中
c.  轻轻混匀转染试剂(这里以DharmaFECT kb为例)，取3μL转染试剂加入稀释好的DNA中形成转染复合物，轻轻吹打均匀
d.  室温孵育10min
e.  弃除培养基，换成0.45mL新鲜完全培养基
f.   每孔添加50μL混合好的转染复合物，轻轻混合均匀
g.  37℃培养
h.  转染48-72h：分析基因编辑结果或预期的基因敲除表型

Edit-R Lentiviral sgRNA载体是tat依赖的，所以必须使用可表达tat基因的慢病毒包装系统，推荐使用Dharmacon Trans-Lentiviral shRNA Packaging Kit(Cat #TLP5912 or TLP5917)。

详见：Dharmacon™ Edit-R™ CRISPR Cas9 gene engineering with Lentiviral Cas9 and sgRNA