1.2.4  稳定敲除-Lentiviral All-in-one sgRNA

a.  解冻甘油菌原液
b.  取甘油菌原液10μL接种至LB肉汤中(含羧苄100μg/mL)，37℃摇床震荡18-19h
c.  使用质粒提取试剂盒提取高纯度质粒(QIAGEN Cat 12362)
d.  取0.2-1μg质粒跑胶鉴定，Edit-R predesigned All-in-one lentiviral sgRNA条带大小在12kb

以24孔板为例

a.  转染前24h细胞铺板：贴壁细胞——每孔铺~5*10⁴个细胞；悬浮细胞——每孔铺~5*10⁵个细胞
b.  将1μg Edit-R All-in-one Lentiviral sgRNA质粒稀释于50μL DMEM或其他无血清生长培养基中
c.  轻轻混匀转染试剂(这里以DharmaFECT kb为例)，取3μL转染试剂加入稀释好的DNA中形成转染复合物，轻轻吹打均匀
d.  室温孵育10min
e.  弃除培养基，换成0.45mL新鲜完全培养基
f.  每孔添加50μL混合好的转染复合物，轻轻混合均匀
g. 37℃培养
h. 转染48-72h：分析基因编辑结果或预期的基因敲除表型

Edit-R predesigned All-in-one lentiviral sgRNA载体是tat依赖的，所以必须使用可表达tat基因的慢病毒包装系统，推荐使用Dharmacon Trans-Lentiviral shRNA Packaging Kit(Cat#TLP5912 or TLP5917)。在包装完成后，建议使用功能滴定方案对慢病毒颗粒进行滴定，例如通过结晶紫染色进行细胞活力测定的限制稀释，或者在含有EGFP载体的情况下通过荧光进行分析

Edit-R All-in-one Lentiviral sgRNA慢病毒颗粒转导 以24孔板为例，使用无血清培养基将慢病毒颗粒转导到哺乳动物细胞的基本步骤如下：

Day 1:
a.  根据使用细胞系的生长特性，对细胞进行铺板处理，使其在转导当天达到40-80%的融合度
b.  37℃，CO₂培养箱中过夜培养
Day 2:
a.  提前将转导培养基平衡至37℃
b.  计算慢病毒颗粒体积，使转导MOI=0.3
c.  冰上融化Edit-R All-in-one Lentiviral sgRNA慢病毒颗粒
d.  融化后，轻轻混合吸取慢病毒颗粒至转导培养基中
e.  弃去板孔中生长培养基，加入0.25mL含慢病毒颗粒的转导培养基
f.   37℃，CO₂培养箱中培养4-6h
g.  转导4-6h后，添加额外的0.75mL声场培养基，继续在37℃，CO₂培养箱中继续培养
Day 3-15: 嘌呤霉素筛选工作流程
a.  转导后24-48h，替换培养基为选择培养基(含嘌呤霉素)
b.  每2-3天更换一次选择培养基，每天监测细胞死亡情况：如果细胞融合度很高，可将细胞分裂到更大的培养皿中，以进行适当的嘌呤霉素选择，例如，将细胞从24孔培养皿分离到6孔培养皿
c.  一旦细胞在选择培养基中正常生长，扩增细胞进行等分冻存
Days 3-5: 荧光标记筛选
a.  转导后24-72h，检测细胞EGFP表达情况：可通过FACS富集细胞
b.  富集到荧光表达细胞株后，扩增细胞进行等分冻存
c.  转导后48-72h可进行基因编辑评估

Q1: 检测基因敲除的最佳方式是？
A1: 错配检测实验；对目的区域进行DNA测序、蛋白质功能检测是确认基因敲除的必要条件

Q2: 确认sgRNA序列的引物是？
A2: 引物(forward): 5'-GGCCTATTTCCCATGATTC-3', sgRNA

序列: G(N19)GTTTAAGA

GCTATGCTGGAAACAG

CATAGCAAGTTTAAATAA

GGCTAGTCCGTTATCAAC

TTGAAAAAGTGGCAC

CGAGTCGGTG

CTTTTTTT. N19部分是目标序列

Q3: 直接转染质粒和转导慢病毒比，它的优势是？
A3: 如果无需在基因组中保持完整的载体拷贝，那质粒转染是首选，可用于快速定性评估；如果需要单拷贝整合时，慢病毒转导是必需的。
一般来说，慢病毒整合确实比瞬时转染编辑效率更高