1.3.2  ORF-CCSB-Broad Lentiviral Expression

该系列ORF甘油菌克隆是由Dana-Farber癌症研究所和Broad,研究所共同开发的，来源于hORFeome V8.1文库，可针对不同细胞类型进行靶向过表达实验

人的ORF被构建至pLX304载体上

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干冰运输，到货后-80℃储存

解冻源管甘油菌，用细菌接种环挑取菌液进行LB平板(含100μg/mL氨苄霉素)划线，置于30℃培养18-24h后，挑取单克隆进行ORF测序验证，确保克隆准确性后，转移至LB肉汤(含100μg/mL氨苄霉素)中进行扩培。培养完成后，吸取920μL培养物置于新的聚丙烯管中，再加入80μL无菌甘油混匀成8%甘油菌冻存液，置于-80℃冻存。

Q1: pLX304载体测序引物序列是什么？
A1:

5'-end forward: CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG;

3'-end reverse: TACGGGAAGCAATAGCATGA

Q2: 存储CCSB-Broad Lentiviral质粒的大肠杆菌是什么类型？
A2: DH5α

Q3: CCSB-Broad Lentiviral克隆载体中的重组位点类型是什么？
A3: Gateway™ attB1 and attB2 sites flank the ORF insert 

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Q4: ORF插入片段侧翼的具体序列信息是什么？
A4: 5'-TCAACAAGTTTGTAC

AAAAAAGTTGGCNNNNN

NNNNNNN(TDC) CCAACTTT

CTTGTA-3'，

”NNNNNN”代表ORF序列，()=密码子是可变的

Q5: CCSB-Broad Lentiviral克隆是否含有天然终止密码
A5: 否，所有的CCSB-Broad Lentiviral克隆都含有C末端V5标签蛋白，在V5标签蛋白3’末端有一个终止密码子

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Q6: 如何包装CCSB-Broad Lentiviral克隆形成慢病毒？
A6: 可使用三代病毒包装系统进行包装，推荐Dharmacon™ Trans-Lentiviral™ ORF Packaging Kit(Cat #TLP5916, TLP5918)慢病毒包装试剂盒

Q7: 如何转染CCSB-Broad Lentiviral质粒？
A7: 可使用适用于转染质粒进哺乳动物细胞的转染试剂，如DharmaFECT kb (Catalog #T-2006)

Q8: 如何找到CCSB-Broad Lentiviral克隆中插入的ORF序列？
A8:  Horizon官网中列出了所有CCSB-Broad克隆ID，点击对应克隆ID，可看到BC accession，也可登陆Public TRC Portal进行ORF序列信息检索：Search by Clone

Q9: 如何创建新的自己感兴趣的ORF CCSB-Broad Lentiviral克隆？
A9:  可以置换两个Gateway位点见的ORF序列，从起始密码子(ATG)到终止密码子，我们推荐从插入片段的两端对克隆进行测序以确认序列准确性。测序引物信息如下：
FWD: 5' - CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG - 3'
REV: 5'- TACGGGAAGCAATAGCATGA - 3'

Q10: V5标签蛋白的目的是什么？如何检测V5标签蛋白？
A10: V5标签是基于病毒蛋白的短肽，针对V5抗原表位的抗体可以很容易地构建或购买。V5标签便于pull-downs和共免疫沉淀实验的开展，以确定蛋白与蛋白之间的相互作用。还可通过免疫荧光标记细胞中表达的ORF

Q11: 有多少氨基酸被添加至ORF序列后？
A11: 总的来说，在最后一个ORF密码子和第一个V5密码子之间有9个氨基酸形成attB2位点，V5标签由14个氨基酸组成，所以总共是有23个氨基酸被添加在每个ORF序列的3’末端和终止密码子的前端

Q12: 如何购买 Blasticidin S?
A12：Blasticidin S：Fisher Scientific(Cat #BP2647-25)

Q13: 在哺乳动物细胞中筛选时使用的Blasticidin S浓度为多少？
A13: pLX304载体本身含有Blasticidin S抗性，为了生成稳定细胞株，通过检测Blasticidin S杀伤曲线来确定杀死未转染、未转导细胞所需的Blasticidin S的最小剂量是至关重要的。