1.3.3 ORF-Precision LentiORF

Precision LentiORFs克隆是将人的cDNA开放阅读框(ORFs)克隆到慢病毒表达载体中，用于在哺乳动物细胞中过表达人的基因和蛋白质，适用于原代或难转染细胞，可用于构建稳定表达的细胞系，研究过表达表型，或进行RNAirescue实验。慢病毒ORF载体无需亚克隆即可表达，编码序列经全长测序，CMV启动子驱动强大的蛋白质表达，GFP荧光报告基团可被转运至细胞核，便于跟踪蛋白表达，Blasticidin抗性可用于稳转细胞株的筛选，二级标签可被添加至编码序列下游的MultiTag克隆位点，提供移除和不移除天然终止密码子的克隆，以甘油菌质粒形式提供。

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a.  解冻甘油菌原液，轻轻涡旋混匀
b.  取甘油菌原液10μL接种至3-5mL 2x LB broth(low salt)肉汤中(含羧苄100μg/mL)，37℃摇床震荡18-19h,
2x LB broth(low salt)medium 准备如下:
LB-Broth-Lennox(Fisher Scientific Cat #BP1427500)20g/L
Peptone(Fisher Scientific Cat #BP9725–2)10g/L
Yeast Extract(Fisher Scientific Cat #BP1422–500)5g/L
Carbenicillin(Fisher Scientific Cat #BP2648–250)100μg/mL
c.  Note: 如果需要更大的培养体积，可将3-5mL培养物37℃培养8h后， 
将其作为起始培养液，按1:500~1:1000稀释培养
d.  离心培养好的3-5mL培养物，开始质粒提取
e.  Note: 为了避免病毒载体发生重组，建议尽可能保证较短的培养时间，每一次质粒提取都需要使用原始甘油菌克隆

以下是使用Thermo Scientific™FastDigest™EcoRI限制性内切酶(Cat#FD0274)对PrecisionLentiORF质粒DNA进行限制性内切分析的方案。EcoRI在ORF 5'端侧翼的attB1位点上游切割15个碱基(对应于ORF起始密码子上游30-50nt，取决于不同的克隆-详见特定克隆信息)。第二个EcoRI位点位于attB2位点下游1348bp处，大致位于ORF最后一个密码子下游约1.37kb处。或者，利用5'端侧接attB1位点的SpeI或PacI，以及3'端侧接attB2位点的NheI或AscI，可以剪切出ORF片段，对于较小的ORF片段，最好使用EcoRI。
a.  设置EcoR1酶切程序：

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b.  轻轻吹打混匀
c.  37℃孵育5min
d.  用1%的琼脂糖凝胶跑胶鉴定切开和未切开的质粒

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Precision lentiorf有 “open”(删除天然终止密码子)和“closed”(保留天然终止密码子)两种形式的克隆(具体参见克隆信息)。

a. “closed”结构ORF的翻译在ORF序列的最后一个意义密码子之后立即终止于其天然终止密码子。
b. “open”结构是为了允许ORF的C端与感兴趣的标签融合。在这些ORF中，翻译终止于attB2位点下游的载体上的终止密码子，在其C端添加了11-16个氨基酸。如果需要，载体上的终止密码子可以被载体上终止密码子两侧的Nhe/AscI位点上的融合标签取代。需注意将融合标签与终止密码子放在同一阅读框中。

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pLOC载体在转导、转染细胞时对BlasticidinS具有抗性。BlasticidinS筛选可用于消除未转导、未转染的细胞。为了生成稳转细胞系，确定杀死未转染、未转导细胞所需的最低BlasticidinS的剂量是十分重要的。建议按照以下程序，通过生成BlasticidinS杀伤曲线来测试您使用的细胞系，许多细胞适用的一般浓度范围为5-15µg/mL。

a.  Day 0细胞铺板：24孔板，每孔铺5*10^4细胞，孵育过夜
b.  培养基准备：根据你的细胞，准备含有不同浓度抗生素的培养基，如0-20µg/mL Blasticidin S
c.  Day 1：将不同孔里的生长培养基替换为不同稀释浓度的含有抗生素的培养基，
d.  37°C, 5% CO₂培养
e.  每2-3天更换新鲜的筛选培养基
f.   每天监测细胞，观察存活细胞百分比。Blasticidin S筛选后，3~6d可达到最佳效果
g.  最低抗生素使用浓度：抗生素筛选开始后3-6天内杀死100%细胞的最低浓度

使用适用转染质粒的转染试剂，推荐使用DharmaFECT kb(Catalog#T-2006-01)

pLOC载体是tat依赖的，所以必须适用可表达tat基因的包装系统，推荐使用Dharmacon™ Trans-Lentiviral™ ORF Packaging Kit(Cat #TLP5916, TLP5918) 慢病毒包装试剂盒

如果你已完成慢病毒包装，可按下面程序确定慢病毒滴度
a.  在病毒转导之前，选用24孔板，进行细胞铺板，每孔铺5*10⁴个HEK293T细胞(DMEM, 10% FBS, 1%链霉素)。接下来的几天里，要确保孔里的细胞不超过40-50%的融合度
b.  使用无血清培养基在圆底96孔板中稀释病毒原液，96孔板的每一行被用于检测一个病毒储存液。使用以下程序(从步骤d开始)进行病毒稀释，目标是产生一系列5倍稀释，最终达到390,625倍稀释。
c.  96孔板中的每孔均加入80µL无血清培养基
d.  在第一列的每孔中加入20µL相应病毒原液，轻轻吹打10-15次，弃枪头
e.  使用新的枪头，吸取第一列每孔中20µL的病毒混合液至第二列，轻轻吹打10-15次，弃枪头

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f.  按步骤额e，梯度稀释至第8列，每一步稀释都需要轻轻吹打10-15次，并注意更换枪头，将稀释后的病毒在室温下预孵育5分钟
g.  在24孔板中的每一行标记待检的病毒混合液

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h.  移除24孔板中的细胞培养基
i.   每孔加入新的225µL无血清培养基
j.   转移源96孔板中的稀释病毒液25µL至准备好的24孔板中，例如，将96孔板中的A2孔转移至24孔板的A1孔：

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k.  将24孔板置于37℃培养4h
l.   移除转导复合物，加入1mL新鲜培养基(DMEM:10 FBS, 1%链霉素)
m. 48h后进行细胞计数
n.  计数表达TurboGFP的细胞或细胞集落，将每个多细胞集落计数为1个转导细胞，因为细胞将在48小时后分裂

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Note：不同LentiORF克隆荧光强度不同，如果你的细胞中荧光强度低，建议在更高的放大倍率下计数菌落
o.  每mL转导单位(TU/mL)可通过以下公式进行计算：#荧光阳性菌落数×稀释倍数×40=#TU/mL，例，A3孔有55个荧光阳性菌落数，55x625x40=1.38×10⁶TU/mL
Note：从非浓缩慢病毒颗粒中可预期10⁶滴度
p.  一旦生成了具有合适滴度的慢病毒原液，就可以将慢病毒载体转导到所选择的哺乳动物细胞系中，并进行重组蛋白表达的检测
q.  感染复数(MOI)：为了获得感兴趣基因的最佳表达，需要使用合适的MOI将慢病毒载体转导到您选择的哺乳动物细胞系中。MOI定义为每个细胞的转导单元数。虽然这是细胞系依赖的，但它通常与每个细胞整合情况的数量相关，因此与转基因表达水平有关
r.  最佳MOI参数确认：许多因素会影响最佳MOI的确定，包括哺乳动物细胞自身的性质(活跃VS非分裂)，其相对转导效率，感兴趣的应用以及感兴趣的基因性质。如果是第一次将慢病毒构建子转导到选定的哺乳动物细胞系中，在滴定之后，我们建议使用一系列MOI(例如，0、0.5、1、2、5、10、20)来确定获得特定应用所需的最佳表达所需的MOI。如果需要最小表达，应该注意，为了实现单拷贝表达，通常使用0.3的MOI，然后进行抗生素筛选，这通常会导致不到4%的细胞具有多个插入物

以下方案是基于慢病毒颗粒转导至Dharmacon HEK293T,OVCAR8或MCF7细胞中，同时在24孔板无血清培养基中进行的优化。如果使用不同的培养皿，请等比例调整细胞的数量、体积和试剂的数量与表面积的变化(表5)。强烈建议您优化转导条件，以适应您的目标细胞系，以获得最高的转导效率。转导最好在无血清、无抗生素的培养基中进行。需要注意的是，血清存在时，转导效率可能降低。但血清存在时，更有可能进行成功的转导；需根据您自身实验需要优化实验参数

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a.  Day 0: 在24孔板每孔中铺5x10^4个细胞，孵育过夜
b.  Day 1: 移除培养基并将病毒添按优化好的MOI添加至细胞中。以类似的方式设置所需的实验组和对照组。将液体的总体积调大，使其刚好覆盖在无血清培养基的细胞上
Note: 如果使用浓缩病毒，需要用到较少的病毒体积和非常多的无血清培养基；如果使用非浓缩病毒，需要用到较多的病毒体积
c.  转导后4-6h，加入1mL完全培养基(含血清和链霉素)，孵育过夜
Note: 在测试的细胞系中病毒转导引起的细胞毒性很低，因此许多细胞系不需要去除病毒。在研究中，如果病毒在6小时后没有被清除，则转导效率更高。但是，如果有毒性问题，请在4-6小时后弃去转导混合物，并用新鲜培养基替换。此外，新鲜的生长培养基应足够供给细胞继续生长的条件
d.  在转导48小时后，显微镜下检查细胞是否存在报告基因表达，因为这是评判转导效率的第一个指标
Note: 如果观察到少于90%的细胞表达绿色荧光蛋白，推荐使用Blasticidin S筛选，从而增加基因过表达水平
e.  如果使用Blasticidin S，需要根据杀伤曲线投放合适的Blasticidin S浓度，如果细胞密度接近或超过50%融合度，推荐在添加Blasticidin S时进行细胞消化分板
f.  每2-3天更换新鲜准备的筛选培养基
g. 每天监测细胞的存活率，在某个时间点上，几乎所有在选择中幸存下来的细胞都将携带目的基因。使用Blasticidin S在3-6天内达到最佳效果，此时所有存活的细胞都将含有目的基因。
Note: 使用的MOI越高，每个细胞中目的基因和Blasticidin S抗性基因的拷贝数就越多。在Blasticidin S筛选时，需要注意的是，在较高的MOIs下，含有多个抗性基因拷贝的细胞比低MOIs下的细胞能承受更高的Blasticidin S浓度。即使在单拷贝中，pLOC载体也能在转导的细胞中对Blasticidin S产生显著的抗性。即使TurboGFP以不可检测的水平表达，转基因表达水平非常低的细胞仍可能在选择中存活。推荐使用未转导的对照细胞来监测筛选过程。如果需要高水平的转基因表达，建议选择更长时间和更高浓度的Blasticidin S，将Blasticidin S的浓度调整到最适靶向细胞的数值，不低于致死曲线中建立的最低抗生素浓度

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h.  一旦观察到转导效率达到可接受的水平(无论是否使用Blasticidin S筛选)，就可通过qPCR、western blot分析或其他适当的功能分析来检测细胞的基因表达。Evrogen TurboRFP表达结构可作为对照
Note: 从转染/转导开始到分析的最佳孵育时间取决于细胞类型、过表达的特定基因

Q1: Precision LentiORFs适用哪种病毒包装系统？
A1: pLOC 载体是tat依赖的，所以必须使用可表达tat基因的包装系统

Q2: 如何构建稳定细胞系？
A2: 首先确定杀死未转染、未转导细胞所需的Blasticidin S的最小剂量，可通过生成Blasticidin S杀伤曲线来实现。在确定了合适的Blasticidin S浓度后，可用构建物转染、转导你的细胞，用Blasticidin S培养，以选择那些具有稳定整合物的细胞

Q3: 哪里可以购买Blasticidin S？
A3: Fisher Scientific(Cat #BP2647–25)

Q4: 如果转导靶向细胞系失败，需要考虑哪些因素？
A4: 1）转导效率与包装生成的病毒质量、数量相关。转导时需要考虑的因素包括MOI(与准确滴度相关)、培养基中血清的存在、聚苯乙烯的使用、暴露于病毒的时间长短以及病毒对特定细胞的毒性都会有影响；2）需要转染高质量的质粒DNA，生成高质量、高纯度的病毒；3）并非所有细胞都适合慢病毒转导，可以考虑测试其他的细胞系