1.3.4  CRISPRa-CRISPRa synthetic crRNA

瞬离crRNA, SAM tracrRNA，确保RNA干粉沉于管底，使用nuclease-free 10 mM Tris -HCl Buffer pH 7.4.(Cat #B-006000-100)进行溶解。例如，将10nmol crRNA溶解至1000µL 10mM Tris -HCl Buffer pH 7.4中，至储存浓度为10µM。轻轻吹打混匀，避免气泡生成

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瞬离后用紫外分光光度计验证crRNA浓度。(crRNA：1µM=13.5ng/µL; SAM tracrRNA, 1µM=33.5ng/µL)

crRNA溶解后可直接使用，也可等分成更小体积限制冻融次数，-20℃保存

以96孔板，crRNA+tracrRNA化学转染稳定表达dCAS9蛋白的细胞系为例

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a.  第一天进行细胞铺板，确保适合下游的表型试验检测
b.  crRNA+tracrRNA混合物配制：用nuclease-free 10mM Tris -HCl Buffer pH7.4稀释混合crRNA和tracrRNA至工作浓度1μM
c.  转染复合物制备：以96孔板单孔为例，管1中添加2.5μL 1μM crRNA+tracrRNA混合物，加无血清培养基补足至10μL；管2中加入0.05-0.8μL DharmaFECT 1-4，加无血清培养基补足至10μL。室温孵育5min，将管1和管2混合，轻轻吹打均匀
d.  室温孵育20min，弃去板孔中的培养基，加入转染复合物
e.  每孔再加入80μL的完全培养基补足至100μL体系
f.   转染48-72h后，进行下游显型实验或基因表达分析