实验步骤
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稳定转染实验步骤
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1）生成可稳定表达dCas9-VPR的稳转细胞系
2）CRISPRa lentivial sgRNA质粒制备
3）慢病毒包装
4）病毒滴定
5）慢病毒转导
6）基因表达分析建议：使用管家基因的表达来规范化靶向基因的表达，进行适当数量的技术重复和适当的对照设置 -
瞬时转染实验步骤
可直接共转染dCas9-VPR和sgRNA表达质粒
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FAQ
Q1：最好的确认基因被激活的方式是？
A1：RT-qPCR
Q2：CRISPRmod CRISPRa系统是否可以应用于非哺乳动物体系，如果蝇或线虫？
A2：CRSIPRmod CRISPRa系统是为哺乳动物表达系统设计的，且在哺乳动物细胞中得以验证，目前所有的预制gRNA都是针对人、小鼠基因的激活。如果想要靶向其他物种，需要进行定制，但是不能够预测和保障激活效果
Q3：CRISPRmod CRISPRa guide RNAs是否可用于其他CRISPRa系统？
A3：CRISPRmod CRISPRa guide RNAs可以和标准gRNA使用系统，如SunTag兼容，但不能够与使用经适体修饰的gRNA将激活子带到dCas9结合位点的系统，如SAM CRISPRa系统。
Q4：怎样确定选用的细胞系转导时使用的CRISPRmod CRISPRaLentiviraldCas9-VPR和 sgRNA病毒颗粒用量？
A4：细胞的成功转导取决于细胞类型、细胞密度、传代数、转导过程中的MOI、慢病毒制备的纯度以及是否添加促转导的试剂(如聚苯乙烯)。可在实验之前用96孔板进行优化，测试最优条件