3.1.1  Oligo Library Synthesis (OLS)

利用混合文库进行的遗传筛选通常用于定位和鉴定与细胞响应(例如，在信号传导通路中)相关的基因，或者发现新基因的功能。混合筛选文库的规模可在低至 100 个构造子到高至数十万个构造子的范围内变化。与阵列方法不同，混合筛选通常不需要大量昂贵的自动化设备。在保证实验设计合理的前提下，通过混合方法，研究人员只需要一些培养板即可筛选大量细胞。只需一个混合样品，便可完成克隆、转化、转染、包装、转导和筛选，并且几乎不需要任何特殊设备，因此对于功能、表型筛选而言，该方法更便于应用

CRISPR 采用的是含有单向导RNA(sgRNA)的核糖核蛋白，其可将酶(通常是Cas9核酸酶)靶向到可对DNA进行修饰的基因位点。为了实现敲除以便进行功能筛选，Cas9 核酸酶在目标位点处诱导双链断裂。利用非同源末端连接对该断裂进行易错修复会造成对目标位点的修饰，并通常会由于插入或删除碱基引起的移码突变导致功能表型的丧失。不同于其他需要大量蛋白质工程的工程化核酸酶，CRISPR系统仅依靠简单的碱基配对来靶向基因组位点，使得该系统能够轻松适用于许多不同的应用和靶标

a.  简单、无需自动化的工作流程
b.  在实验室中轻松进行高通量功能基因组学实验
c.  灵活性强，可筛选数百个到数十万个向导

a.  寡核苷酸文库设计：电脑模拟设计向导序列列表
b.  混合gRNA寡核苷酸序列合成：推荐使用Agilent OLS合成平台，可提供最多244K序列合成，合成序列长度区间为30-230mer，序列保真度和均一度高
C.  gRNA切割和PCR扩增
D.  克隆和纯化：推荐使用Agilent SureVector克隆试剂盒，生成混合质粒文库
E.   病毒包装：生成混合病毒sgRNA文库
F.   病毒转导稳定表达Cas9蛋白靶细胞系
G.  设置处理组和对照组
H.  筛选和活性分子测序(NGS)
I.   活性分子验证及后续工作
J.   活性分子的深度细胞学分析：N35(TE)，代谢组学，Seahorse
K.  通路分析：耐药性KO分析
L.  软件和分析工具：GeneSpring

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