3.1.3 Lentiviral sgRNA

Edit-R Lentiviral sgRNA混合文库是表达sgRNA的慢病毒构建子文库，靶向编码基因进行敲除。基因敲除混合筛选可用于识别编码基因在细胞反应和信号通路调控中的功能，且不需要昂贵的自动化和阵列筛选所需的仪器。Edit-R Lentiviral sgRNA混合筛选平台是双载体系统，利用一个用于Cas9表达的慢病毒载体和一个用于sgRNA表达的基因特异性载体，每个基因设计5~10个特异性sgRNA，100个阴性对照构建子，多达340个基因特异性阳性对照构建子。

 

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1）Edit-R Lentiviral Cas9 Nuclease 和 sgRNA 载体信息：

 

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2）Edit-R Lentiviral sgRNA混合病毒文库筛选流程概述：
- 确定好载体骨架、基本转导和实验条件，就可以生成稳定表达Cas9的细胞系。后续的基因敲除筛选可以通过直接转导Edit-R Lentiviral sgRNA进行。细胞在低MOI下用慢病毒pool进行转导(如下图)，由此产生的转导细胞群中，大多为单个细胞整合单个sgRNA构建子到基因组中。转导后，添加选择压力，使参与特定生物反应的结构子被识别。选择压力会导致表达sgRNA结构的细胞在细胞群中富集或减少

- 为了确定“Hits”，从初始转导细胞群(参考样本)和选择压力/表型选择后的转导细胞群(实验样本)中分离gDNA。gDNA中的sgRNA构建子使用经设计和优化的Edit-R Pooled sgRNA正向和反向Index PCR引物进行扩增，最大限度地减少扩增偏倚。扩增后，Index反应产物可直接加载到Illumina平台上，并使用Edit-R Pooled sgRNA Read 1和Index Read Sequencing引物进行测序。然后可以确定参考细胞群和实验细胞群之间sgRNA结构丰度的差异，从而得到初筛“Hits”

• 慢病毒混合筛选流程的每一步，从转导到“Hits”识别，都经过了经验测试。Edit-R Lentiviral sgRNA Pooled Screening Library平台包括通用的Illumina PCR引物，用于在Illumina仪器上通过高通量测序从gDNA中鉴定sgRNA序列。Edit-R Pooled sgRNA正向和反向Index PCR引物具有内置的适配器和Index序列，使研究人员能够轻松地从PCR扩增转移到Illumina平台高通量测序。直接鉴定sgRNA序列有利于数据分析，确保准确鉴定靶基因

 

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1） Cas9表达的最优启动子选择：
Cas9核酸酶的表达水平对基因敲除效率有显著影响。因此，需要根据经验测试或已知启动子活性，选择细胞系中启动子活性最高的慢病毒Cas9核酸酶载体
2） 慢病毒转导条件优化：
a.  转导培养基：选用小体积的低血清(0.5-2%)或无血清培养基，针对低血清条件敏感的细胞，可在完全培养基中进行转导优化
b.  转导持续时间：孵育时间在4-24h，取决于使用的靶细胞
c.  培养基添加剂：可以添加阳离子聚合物(如Polybrene)，以增强慢病毒颗粒与细胞表面的结合。我们建议测试0-10μg/mL的浓度范围，以确定最小或无细胞毒性的最佳转导效率。如果Polybrene 对目标细胞有毒性，可以用 DEAE-Dextran(1-10μg/mL)或Protamine Sulfate(1-50μg/mL)替代
d.  转导时细胞密度：细胞铺板的密度也可能影响转导效率，建议在一定密度范围内铺细胞，以优化转导效率
3） 功能性效价确定：功能效价可通过荧光显微镜或FACS分选的方法计数GFP、RFP阳性克隆
   Day 1:
a.  在转导前一天，进行靶细胞96孔板铺板(目标96孔板)
b.  使用含血清、Polybrene的培养基进行病毒的稀释，在圆底96孔板中进行5倍梯度稀释，最终稀释至390625倍(推荐使用两个重复)，具体稀释操作如下：

 

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c.  在A1和B1孔中加入40μL稀释培养基，在A2-A8和B2-B8孔中加入80μL稀释培养基
d.  冰上融化Edit-R Lentiviral sgRNA Non-targeting Control Particles，随后分别在A1, B1孔中加入10μL病毒颗粒，上下移液10-15次混匀，弃枪头
e.  将A1, B1中的20μL混合物分别转移至A2, B2中，上下移液10-15次混匀，弃枪头
f.   重复步骤e进行梯度稀释，直到稀释至第8列，每转移一次，均需上下移液10-15次混匀，弃枪头
g.  室温孵育3-5min，使病毒颗粒与Polybrene充分混合，形成转导复合物
h.  移除目标96孔板中铺好的细胞
i.   取稀释板中每个稀释度的病毒悬液25ul至对应的目标96孔板中，避免产生气泡
j.   细胞孵育4-24h
k.  在每个孔中添加75μL常规生长培养基
l.   细胞孵育48-72h(根据转导优化条件确定最终时间)
m. 在目的96孔板中选择一个孔，计数表达GFP/ RFP的细胞数。将每个多细胞集落计数为一个转导单位，因为细胞培养期间一直在分裂。计算每个重复板的同一目的孔中GFP/ RFP阳性细胞数的平均数量

 

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4） blasticidin和puromycin筛选优化：Edit-R Lentiviral Cas9核酸酶表达载体含有blasticidin抗性标记，而Edit-R Lentiviral sgRNA载体含有puromycin抗性标记，用于转导后细胞的选择。在用blasticidin或puromycin处理细胞之前，确定杀死非转导细胞所需的每种抗生素的最佳浓度。这个浓度可以通过抗生素致死曲线来确定。许多哺乳动物细胞的blasticidin范围为2~20μg/mL，puromycin为0.5~10µg/mL。
Day 1:
a.  将细胞以合适的密度置于生长培养基中进行铺板，过夜孵育
Day 2:
b.  将生长培养基换成选择培养基(含有不同浓度范围的抗生素)
Day 4-15:
c.  每2-3天进行一次新鲜选择培养基换液
d.  每天监测细胞状态，观察细胞存活率，puromycin筛选在3-6天达到最优效果，blasticidin筛选在5-15天可达到最佳效果
e.  选择在3-15天内杀死100%细胞的最低抗生素浓度进行筛选
5） 特定筛选条件确定：SMARTvector慢病毒载体主干包含puromycin可选择标记，允许选择整合了sgRNA构建的细胞。根据您的选择，sgRNA慢病毒载体也可能包含TurboGFP或TurboRFP荧光报告蛋白，以便FACS选择分离表达TurboGFP或TurboRFP的细胞。在使用嘌呤霉素选择产生纯转导细胞群之前，确定杀死非转导细胞所需的最佳嘌呤霉素浓度是很重要的。这个浓度可以通过生成嘌呤霉素杀伤曲线来确定。
6） 平均倍数和生物重复数选择：慢病毒混合筛选的一个关键考虑因素是库中任何给定构建子在筛选中表示的程度。换句话说，包含任何给定构建子的独立基因组整合的细胞数量、每个构建子整合事件和随后的表型选择的生物重复数量。高结构表征导致生物重复之间的高再现性，并确保有足够的窗口来检测表型选择后结构表征的变化。推荐：每个构建子有500到1000个独立的整合细胞；至少2个生物重复
7） 计算转导所需的细胞数：MOI定义为慢病毒颗粒与靶细胞的转导单位比。在高MOIs下，每个细胞可能被多个慢病毒颗粒转导。相反，在低MOIs下，每个细胞被多个慢病毒颗粒转导的概率很低。在慢病毒混合筛选中，每个细胞理想状态是表达单一构建体。这确保特定细胞中单个基因的敲低是导致最终表型变化的原因。因此，我们建议在MOI≤0.3时进行慢病毒转导。

 

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8） 计算转导所需的病毒粒子数：以混合病毒文库：25ul/管，滴度≥5×108 TU/mL为例：

 

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1） 细胞转导和筛选：

 

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A.  转导Edit-R Lentiviral Cas9 Nuclease 慢病毒颗粒：在筛选之前，首先使用Edit-R Lentiviral Cas9慢病毒颗粒生成稳定表达Cas9的细胞系
Day 1:
a.  细胞铺板：需根据转导时所需的细胞数量、细胞类型来确定铺板细胞数量，过夜培养
Day 2:
b.  第2天，移除细胞培养基，添加含合适数量Edit-R Lentiviral Cas9 Nuclease慢病毒颗粒的转导培养基
c.  在合适的转导时间后(4-24h)，添加额外的生长培养基，孵育48-72h
Days 4-14:
d.  转导48-72h后，进行blasticidin筛选，用来消除非转导细胞
e.  每48-72h，更换新鲜blasticidin筛选培养基，如果需要的话，可进行细胞传代
Note: 使用blasticidin致死曲线确定最适的浓度
- 一旦获得稳转细胞系(5-10天)，进行扩培，保证足够的细胞用于筛选，计算转导所需的细胞数。推荐使用sgRNA阳性对照慢病毒颗粒进行Cas9稳转细胞系的基因编辑情况
B.  使用Edit-R Lentiviral sgRNA混合文库进行Cas9稳转细胞系转导
Day 1:
a.  Cas9稳转细胞系铺板：需根据转导时所需的细胞数量、细胞类型来确定铺板细胞数量，过夜培养
Day 2:
b.  第2天移除培养基，添加含有合适数量的Edit-R Lentiviral sgRNA慢病毒文库，如果一个慢病毒pool需要被添加至多块板子中，需要均匀等分慢病毒溶液体积
c.  在合适的转导时间后(4-24h)，添加额外的生长培养基，孵育48-72h
Days 4-18:
d.  转导48-72h后，进行puromycin筛选，用来消除非转导细胞
e.  每48-72h，更换新鲜puromycin筛选培养基，如果需要的话，可进行细胞传代
Note: 使用puromycin致死曲线确定最适的浓度
-一旦获得puromycin抗性细胞系(2-6天)，开始进行筛选。将细胞分成两个组群，一组为对照组(不做任何处理)，另一组为实验组(应用选择压力和/或对感兴趣表型的细胞进行分选)，为了在每个细胞传代中保持所需的sgRNA丰度，始终至少保留与所需慢病毒整合物数量相对应的细胞数量
2） 基因组DNA提取：推荐使用Qiagen Blood and Cell Culture DNA Maxi Kit
a.  收集细胞计数、分离DNA。为了在gDNA分离期间保持所需的转导sgRNA细  
胞数，至少使用与慢病毒整合细胞数相对应的细胞数量。最准确的结果是在分离DNA前对细胞数量进行计数，按照试剂盒说明书从细胞培养物中纯化gDNA。为了确保DNA的高质量和产量，不要使用超过说明书推荐的细胞数，并确保您的DNA完全溶解
b.  用分光光度计定量分离的gDNA，并通过测量A260/280和A260/230的吸光
度比来评估DNA纯度。高质量的gDNA样品的A260/280比值为1.8~2.0，说明不存在蛋白质污染，A260/230比值大于2.0，说明不存在其他有机污染物
3） PCR扩增：这里描述的PCR扩增和高通量测序工作流程，旨在无偏倚地从gDNA中扩增sgRNA构建子，测序结果构建子表达的差异是由于初级筛选期间引起的sgRNA富集或耗尽。在PCR扩增步骤中，每个构建子中使用足够的模板拷贝是非常重要的，这确保了分析的重复性、促进靶点识别
a.  PCR反应数：
-假设每个细胞(基因组)整合了一个sgRNA构建子，计算所需的gDNA的量。

 

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Note:以上计算公式假设是人的双倍体基因组，许多细胞系不是双倍体，所以计算需要根据细胞系类型进行调整。例如，小鼠双倍体细胞系：6.1*10^-3ng/genome

-使用Phusion Hot Start II DNA优化PCR条件，推荐每个PCR最多使用825ng gDNA，更多的gDNA将抑制反应效率，导致PCR失败或扩增偏倚。使用以下公式计算每个样本需要进行的PCR反应数：

 

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-例，一个由1000个构建子组成的混合病毒文库，需要的gDNA投入量和PCR反应数如下表：

 

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-使用如下公式计算整个筛选所需的PCR反应数：

 

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-使用如下公式计算每个慢病毒混合文库所需的Phusion DNA聚合酶的量：

 

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b.  高通量测序样本多重检测：-大多数高通量测序平台提供足够多的序列读取，以允许在测序运行中进行多样本检测(在一个通道中运行多个样本)。为了更准确地识别靶点，建议每个构建子至少获得1000reads。如果您的测序平台的输出高于每个样本所需的读取数，则可以在同一运行中进行多样本检测。为了计算每个通道可以加载的最大样本数，建议将测序平台的读取规格调整为0.7来估计实际读取次数。使用如下公式计算测序平台每条通道可以进行多少样本检测：

 

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-Edit-R pooled sgRNA indexing PCR引物为50μM的正向和反向引物，具体参考下表：

 

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c.  gDNA PCR: 一旦确定了每个样品所需的PCR反应数量和多重样本检测能力，
就可以进行PCR。使用Phusion Hot Start II DNA聚合酶对gDNA序列扩增条件进行优化。已经确定了推荐的扩增条件，以提供最大的PCR产物产量，同时保持在对数扩增的线性阶段。
① 使用96孔PCR板，50μL反应体系，进行PCR。优化的PCR条件为每50μL反应扩增825nggDNA。如上所述，计算扩增总DNA所需的反应次数。下表为50μL PCR扩增反应所需的组分和体积：

 

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② 使用下表所示的PCR循环条件进行Edit-R sgRNA构建子的PCR扩增。本说明书中提供的循环条件确保Phusion Hot Start II DNA聚合酶在扩增时处于指数阶段。如果使用另一种聚合酶，则应根据经验确定最佳循环条件

 

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③ 使用2%琼脂糖凝胶进行10μL PCR产物电泳，确认从每个样品军获得357个碱基对扩增子。
Note: 由于PCR循环次数少，纯化前产物在凝胶上仅有一条微弱的条带
④ 将相同gDNA样品的扩增产物置于一个1.5mL的指形管中，使用PCR纯化试剂盒纯化每个gDNA样品的PCR扩增子
Note: gDNA通常与PCR产物共纯化，虽然gDNA污染不会干扰NGS测序结果，但它确实会影响分光光度法或荧光法定量PCR扩增子的数量。因此，建议使用qPCR或色谱方法(如Agilent生物分析仪)评估每个扩增子的浓度。或者，扩增子可以通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并通过荧光DNA定量方法，如QuBit™(Life Technologies))进行定量

Illumina测序平台应遵循其操作说明，包括使用推荐的质量标准来定量文库、文库的稀释和变性

-对于Illumina MiSeq Desktop测序仪，推荐使用10%的PhiX Control作为内参，并使用标准上样体积(7-10pM)将文库上到通道中。将样品装入Illumina MiSeq试剂盒后，将5μL 100μM Edit-R Pooled sgRNA Read 1测序引物加入“Read 1 Primer mix”中，并将5μL 100μM Edit-R Pooled sgRNA Index Read测序引物加入Illumina MiSeq试剂盒上的“Index Primer mix”中(请查看MiSeq系统用户指南进行确认)
Note: PhiX Control包含A, T, G, C核苷酸的平衡，避免筛选结果测序不平衡或低多样性文库

-对于Illumina HiSeq 2500系统，推荐使用10%的PhiX Control作为内参，并使用标准上样体积，将6pM 文库上到Rapid Run中(onboard clustering)，或将7.5pM文库上到High Output Run中(c-bot clustering)，将Edit-R Pooled sgRNA Read 1测序和Edit-R Pooled sgRNA index Read 测序引物分别稀释至对应的illumina引物试剂中，以达到使用终浓度0.5µM

-如下图所示，至少需要19个碱基单端读取来对sgRNA靶向序列进行测序

 

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序列文件的比对和“Hit”识别需要使用一定的生物信息学知识背景配合开源程序进行，推荐您咨询生物信息学专家进行数据分析和“Hit”识别，样本需要在测序仪中进行分离，将每个index标签放入适当的样本中。

每个read的前19个碱基对应sgRNA靶向序列，足够区分不同构建子。Read中剩余的碱基包括sgRNA载体骨架，在随后的分析中可以忽略。使用比对工具，如Bowtie 2，将每个read的前19个碱基与慢病毒混合文库提供的参考文件进行比对。Bowtie 2有一个选项，可忽略3'端碱基的读取，使用此选项来比对sgRNA的前19个碱基。输出比对结果，计算每个构造子的比对数量。接下来，使用为离散计数数据构建的微分表达式工具(如DESeq)来确定初筛“Hits”。确定后，再单独购买相应的Edit-R Lentiviral sgRNA构建子作进一步验证。

 

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Q1: 每个慢病毒pool可进行多少次筛选？
A1: 这取决于3个因素：1） 靶细胞系/细胞类型的转导效率；2）选择在整个筛选中保持每个sgRNA构建子出现的次数(fold representation)；3）一次筛选需要的生物重复数 

 

Q2: 怎样判断靶细胞类型是否能够进行Edit-R Lentiviral Cas9 Nuclease and sgRNA慢病毒转导？
A2: Edit-R Lentiviral Cas9 Nuclease and sgRNA载体具有VSVg包膜蛋白的伪分型，适合于绝大多数细胞的转导，但不同细胞转导效率可能存在不同。靶基因调控的效率不是成功转导的唯一因素，还取决于由选定的启动子驱动的转基因表达的效率

 

Q3: Edit-R Lentiviral Cas9 Nuclease or sgRNA 慢病毒颗粒是否可以在实验室进一步扩繁？
A3: 不可以。Edit-R慢病毒产品经过生物安全设计，作为不可复制的慢病毒颗粒提供

 

Q4: 使用人源细胞系进行筛选实验，是否应该在Cas9 nuclease载体中选择人源相关启动子？
A4: 在某些情况下，启动子活性与其来源的物种有关。然而，启动子的活性并不总是遵循物种特异性的表达模式。例如，我们观察到小鼠启动子在某些人类细胞系中最活跃，而人类和小鼠启动子在某些大鼠细胞中最活跃。在特定细胞系中选择最有效的启动子并不总是可预测的，因此应该根据经验来确定

 

Q5: 慢病毒颗粒的储存方式？
A5: 所有慢病毒颗粒产品必须在-80℃下保存。如有必要，可在第一次解冻时将慢病毒颗粒进行分装，并将分装物保存在-80℃，以尽量减反复冻融次数

 

Q6: 慢病毒颗粒可以保存在4℃吗？
A6: 不可以。一旦解冻，慢病毒颗粒的滴度就会开始下降。建议不要将任何慢病毒颗粒储存在4℃，所有慢病毒颗粒产物必须冷冻保存在-80°C，直到进行转导之前再取出