3.2.1 siRNA文库

siRNA以核酸冻干粉形式室温运输，到货后应置于-20°C保存。在这些条件下，siRNA可稳定保存至少1年。如有必要，siRNA可以干粉形式(未开封)在4°C下保存数周

1）简单瞬离96/384孔板，使siRNA沉积于板孔底部
2）用70%的酒精擦拭锡箔膜
3）小心撕开锡箔膜，动作需轻柔，避免锡箔膜破碎
4）用无RNA酶的水将5x siRNA Buffer稀释至1x浓度(重悬缓冲液)
5）如下表所示，将siRNAs稀释至合适的储存浓度

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6）上下移液3-5次混匀，避免气泡产生
7）将溶液置于震荡器上，室温下轻轻震荡70-90分钟，确保充分混匀
8）简单瞬离，使siRNA沉于板孔底部
9）此时siRNA可直接进行实验，也可置于-20℃，推荐等分成多块子板
- 聚丙烯板适用于-80°C储存，经常用于等分子板
- 聚苯乙烯板适用于-20°C储存，在-80°C时易破裂
10）使用合适的黏性膜或热封膜密封板子
11）尽量避免反复冻融，一块板子最多可反复冻融15次，但为了获得最佳的实验结果，建议一块板子反复冻融不超过5次。在这种保存条件下，siRNA至少可以稳定6个月

1）96孔板文库形式：
a.  96孔板耗材：NUNC Polystyrene 96 well V- bottom plates(Cat #249952)
b.  封口膜：Agilent Peelable Aluminum Seal(Cat #24210-001, white) OR Thermo Scientific™ Easy Pierce™ Heat Seal(Cat #AB-3738, silver)
c.  每块96孔板含80个孔的siRNA，第1列和第12列空出

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2） 384孔文库形式：
a.  384孔耗材：Thermo Scientific™ ABgene™ 384-Well Storage Plate (Polypropylene, Pyramidal bottom) (Cat #AB-0781)
b.  封口膜： Agilent Peelable Aluminum Seal (Cat #24210-001, white) OR Thermo Scientific™ Easy Pierce™ Heat Seal (Cat #AB-3738, silver)
c.  有两种模式可供选择：① 每块384孔板含280个孔的siRNA，A和P行空出，1, 2列和23, 24列空出(如下图)；② 每块384孔板含320个孔的siRNA，1, 2列和23, 24列空出

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建议在每次转染实验中加入下表所列的对照样本，所有步骤应在洁净环境中使用无菌技术进行。建议每次转染实验进行三次重复，以便对结果进行统计分析。为了考虑移液损耗，所有试剂都应适当过量制备

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实验操作步骤(以转染Hela细胞为例)：
a.  以100μM siRNA储存浓度，使用DharmaFECT 1作为转染试剂为例：取1.8μL DharmaFECT 1至373.2μL无血清和无抗生素的培养基中，终体积为375μL
b.  准备3个指形管，每个管中加入100μL稀释后的DharmaFECT 1和0.25μL的siRNA储存液(阴性对照、阳性对照及实验组siRNA)，分别混匀
c.  将siRNA: DharmaFECT复合物等分成25μL/孔的体积，分别加至96孔板的3个独立孔中
d.  室温孵育30min
e.  胰酶消化Hela细胞，制备1x10^5 cells/mL的无抗生素细胞悬液
f.   在含转染复合物的孔中加入0.1mL的细胞悬液，至终体积125μL/孔
g.  置于37℃，5% CO₂孵育24-48h(mRNA检测分析)，48-96h(蛋白检测分析)
h.  如果24h后观察到细胞毒性，建议用新鲜的完全培养基替换转染培养基后继续孵育。细胞活力实验可通过alamarBlue,MTT进行验证，或者应用其他实验进行细胞代谢活性测定。为了呈现最好的实验结果，细胞活至少要大于80%

Q1: 如何定量重悬的siRNA?
A1: 使用分光光度计进行A260的测定

Q2: 为什么稀释后计算出来的RNA的量和出厂标签上的有差别？
A2:  1x siRNA Buffer中的盐离子会减少RNA的吸光度数值；不同的检测仪器也会有影响，推荐使用双光束紫外可见分光光度计；siRNA浓度太高或太低；siRNA没有充分混匀

Q3: siRNA 室温放置一周，还能正常使用吗？
A3: 可以的，前提是未溶解稀释的核酸冻干粉siRNA，这种状态下可室温放置2-4周。但是，我们仍推荐siRNA到货后立马置于-20, -70或-80℃保存

Q4: siRNA的平均分子质量是多少？
A4: 13,300g/mol

Q5: 如何从nmol换算成μg？
A5: 以5nmol siRNA为例：(5nmol)(13,300g/mol)(mol/10⁹nmol)(10⁶μg/g)= 66.5μg