3.2.2 sgRNA文库

1） sgRNA文库以核酸冻干粉形式储存于96孔板板孔底部，室温运输，到货后需储存于-20℃
2） 短暂离心96孔板，确保sgRNA全部沉于96孔板孔底
3） 用70%酒精或无RNA酶污染的溶液擦拭封口膜
4） 小心撕开封口膜，避免暴力撕碎
5） 以0.5nmol规格文库为例：每孔加入50μL不含核酸酶的10mM Tris pH7.4 buffer，生成10μM sgRNA储存液，如下表：

 

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6） 用移液器上下吹打3-5次，避免产生气泡
7） 重新贴好封口膜，置于振荡器上室温轻轻震荡70-90分钟，确保完全混匀
8） 简单离心，确保板孔中的溶液全部沉于孔底
9） 分装子板：按照筛选次数需求，将母板中10μM sgRNA进行稀释分装，生成2μM sgRNA子板，以排除后续小体积移液的限制
10） 稀释分装好的sgRNA子板可直接进行筛选实验，也可置于-20℃保存
11） 需注意，为了方便储存，避免液体蒸发，需要使用合适的粘性封口膜或热封膜

以下操作步骤基于稳定表达Cas9蛋白的哺乳动物细胞系，在96孔板中进行sgRNA的阵列筛选；最优的铺板细胞数取决于靶向细胞系的生长特性和下游检测需求；推荐筛选过程中设置以下几种对照：空白细胞对照、阳性sgRNA对照、阴性sgRNA对照。该操作说明使用的sgRNA终浓度为25nM，1个基因做3个重复。计算4个重复所需的体积，方便移液，避免因移液损耗导致体积缺失。本方案直接使用含5μL 2μM sgRNA的子板制备转染混合物，尽可能减少移液和手动操作过程
1）使用无血清培养基稀释转染试剂至工作浓度。准备9mL稀释好的转染试剂体积，该体积足够转染3块96孔板。例如，假设最优转染试剂用量为0.1μL/孔，添加48μL转染试剂至无血清培养基中，使终体积为9mL。如下表所示：

 

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2）向每孔含5μL 2μM sgRNA的96孔板(V底)中加入75μL稀释好的转染试剂，使每孔体积达80μL，此时sgRNA浓度为125nM
3）立即上下吹打混匀，室温孵育20min
4）孵育结束后，移液器上下吹打充分混匀
5）将转染复合物添加至细胞：
a.  Forward transfection：提前一天进行细胞铺板，转染开始之前，更换新鲜培养基(80μL/孔)，每孔再加入20μL转染复合物，使每孔终体积为100μL，sgRNA终浓度为25nM。重复上述操作，完成另外两块96孔板的溶液替换和添加
b.  Reverse transfection：将转染复合物添加至对应的96孔细胞培养板中，每孔添加20μL，随后每孔加入80μL提前制备好的细胞悬液，使每孔终体积为100μL，sgRNA终浓度为25nM
6）将培养板置于37℃培养48-96h，随后进行表型实验测定或基因表达分析

Q1: 如何储存sgRNA？
A1: 在-20℃或-80℃储存，避免反复冻融。推荐将sgRNA重悬至如下储存浓度，并进行分装，sgRNA反复冻融不超过4-5次
 

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Q2: Edit-R sgRNA的稳定性如何？
A2: 核酸冻干粉形式可室温稳定2-4周，-20或-80℃可长期储存，至少稳定1年

Q3: 是否可以使用除了DharmaFECT系列转染试剂以外的其他转染试剂？
A3: Dharmacon无法保证其他转染试剂的转染效果，但是，其他合适RNA转染的转染试剂也可以使用，使用前需要根据靶细胞系优化转染条件

Q4: 可以将sgRNA文库与Edit-R Ca9核酸酶表达质粒进行共转？
A4: 可以，但须搭配合适的共转试剂，如DharmaFECT Duo。然而，在高通量表型筛选实验中，在稳定表达Cas9核酸酶的细胞系中转染sgRNA可产生更高效率的基因编辑，且与转染相关的细胞毒性较低。如果不能生成稳定表达Cas9的稳定细胞系，推荐使用sgRNA与Cas9 mRNA或Cas9蛋白共转

Q5: Edit-R sgRNA文库以什么形式提供？
A5: 96孔板形式：80个孔，第1列和12列空出；384孔板：320个孔，第1, 2, 23和24列空出