2.2 Monocyte Derived Macrophage单核细胞的诱导分化

①在无菌条件，从全血中分离PBMC。

②RPMI 1640 完全培养基的配制：加入胎牛血清(最终浓度达10%)和2mM左旋谷氨酰胺到 RPMI 1640 培养基。使培养基的温度达到37°C。可选：添加1% 的青霉素-链霉素(5000 单位/mL)。

③重悬细胞于RPMI 1640 完全培养基中，使细胞浓度达2x10⁶个细胞/mL。

④将细胞溶液转移到细胞培养皿中。

⑤在37°C 、 5% CO₂ 的培养箱中培养24小时，使单核细胞贴壁。

⑥在无菌锥形管中，制备含40-50ng/mL M-CSF的RPMI 1640 完全培养基。可选：加入20ng/mL 的 IL-4

⑦用含M-CSF和IL-4的培养基替换培养皿中的培养基。

⑧在 37°C 、5% CO₂ 的培养箱中培养细胞6天。在这6天内，每隔3–4天，补充含40–50ng/mL M-CSF的RPMI 1640 完全培养基(可选：加入20ng/mL的IL-4)。用显微镜检查细胞健康和生长密度。

⑨当细胞质中出现很多颗粒，且细胞略有伸长时，就可以收集细胞。此外，大量的细胞应贴附于培养板上。当收集细胞时，丢弃旧培养基，用1XPBS冲洗培养皿两次，每次冲洗后都丢弃PBS。

⑩向每个培养皿加入10mL 10mM EDTA，在室温静置10分钟或直到细胞不再贴附于培养皿。

⑪将细胞收集在50mL锥形管中，在室温下300–400xg离心4-5分钟。

⑫丢弃上清液，并用1X PBS冲洗细胞。300–400xg离心4-5分钟。

⑬丢弃上清液，用流式染色缓冲液或培养基重悬细胞。