凋亡细胞在早期Phosphatidyl-serine(PS)会由细胞膜内外翻至膜外,利用Annexin V通过流式或电镜能够检测到PS的外翻。
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实验步骤
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流式实验步骤:
取流式管,按顺序编好阴性对照管(空白管、阴性管、单阳管)和样本管号,用冷的PBS洗细胞2次,用1×binding buffer制成1×106/ml细胞悬液
流式管中分别加入100ul细胞悬液,单阳管中分别加入样本管加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI碘化丙啶轻轻混匀
样本管加入5μl Annexin V-FITC,轻轻混匀;再加入10μl PI
室温(20-25°C)避光孵育10-20分钟,随后置于冰浴中
即可上机检测,Annexin V-FITC为绿色荧光,碘化丙啶(PI)为红色荧光
tips:如果用药物作用于细胞,建议将药物浓度、作用时间设置为不同梯度
流式实验结果:
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1. 以Annexin V-FITC标示外翻的PS,再合并以PI进行的死亡细胞的染色,以区分三种细胞。
2. 凋亡细胞可被Annexin V-FITC染成绿色,但对PI拒染;
3. 已死亡或Apoptosis后期的细胞因细胞膜已破损会同时染上Annexin V-FITC与PI;