2.4.3 凋亡事件3：Caspase activity assay kits / 检测 Caspase 活化

当Cytochrome C释放至细胞质中，会导致Caspase活化，而活化的Caspase会引发一连串的蛋白质酶解作用（proteolysis cascade）,将凋亡信息送至更下游的物质，造成细胞的特征性型态改变。

一、Caspase家庭介绍

 

△点击放大图片

二 、凋亡中Caspase作用机制

Caspase是凋亡重要的启动子。凋亡最早和最常检测到的特征之一是一系列名为caspases的胞浆蛋白酶的激活。当凋亡激活时，caspases一起水解多种蛋白底物，从而使细胞结构和功能缺失，最终导致细胞死亡。尤其是caspase-8、-9和-3都与凋亡有关：Caspase-9在线粒体通路上，Caspase-8在Fas/CD95通路上，Caspase-3位于下游，由多条通路激活。
  
优宁维拥有多种检测Caspase的试剂，尤其是针对Caspase-3。包括直接针对激活形式的caspase抗体，这些抗体有多种荧光标记，可用于流式细胞术、细胞成像、ELISA和WesternBlot。

检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的Caspase 活性
                       
检测方法：流式 、WB 、IF 、IHC 、ELISA等 

 

△点击放大图片

△点击放大图片

 

△点击放大图片

 

Caspase-3流式染色结果

左图为：未诱导凋亡细胞，Caspase-3染色为阴性。

右图为：诱导凋亡的细胞，Caspase-3染色为阳性。

 

△点击放大图片

 

流式案例结果说明：Quadrant analysis of active caspase-3 phycoerythrin staining by flow cytometry of HL-60 cells treated with curcumin n at concentrations of 10 mM (B), 15 mM (C), 20 mM (D), and 40 mM (E). At least 10,000 cells were analyzed per sample,and quadrant analysis was performed. The proportion (%) of cell number is shown in each quadrant Q1þQ3, caspase-3 cell number is shown in each quadrant Q1þQ3, caspase-3

△点击放大图片

 

Western blot 分析未处理或 staurosporine （星胞菌素） (1uM, 3hrs) 或 etoposide （依托泊苷）(25uM, 5hrs)处理的C6 (大鼠源)、NIH/3T3 (小鼠源)和Jurkat (人源) 细胞。抗体采用Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 兔单抗。

 

△点击放大图片

 

采用Caspase-3 (8G10) Rabbit mAb兔单抗对未处理和staurosporine（1uM，3hrs）刺激的人HeLa细胞和老鼠NIH/3T3 细胞进行免疫印迹分析（western blot）。

△点击放大图片

 

采用Caspase-3 (8G10) Rabbit mAb兔单抗对未

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded mouse embryo, using Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb in the presence of control peptide (left) or Cleaved Caspase-3 (Asp175) Blocking Peptide (#1050) (right).

△点击放大图片

 

Confocal immunofluorescent images of HT-29 cells, untreated (left) or Staurosporine #9953 treated (right) labeled with Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb (green). Actin filaments have been labeled with Alexa Fluor 555 phalloidin  #8953 (red). Blue pseudocolor = DRAQ5 #4084 (fluorescent DNA dye).