5.1 坏死性凋亡

坏死性凋亡是程序性裂解细胞死亡的途径，其被认为在某些退行性或炎性疾病期间在杀死病原体感染的细胞和/或受损细胞中起作用。坏死性凋亡可以通过多种先天免疫信号传导途径诱导，包括通过刺激RIG-I样受体，TLR和死亡受体引发的途径。这些信号通路都导致坏死性激酶RIPK3（受体相互作用的丝氨酸-苏氨酸激酶3）的磷酸化和活化，在死亡受体诱导的坏死性凋亡的情况下也需要RIPK1活性。RIPK3通过磷酸化激活假激酶MLKL（混合谱系激酶结构域样），引起其构象变化和活化，活化的 MLKL定位到质膜引起膜通透性变化 。 

一 、坏死性凋亡之信号通路

 

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二、坏死性凋亡的引发因素

 

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三、坏死性凋亡的重要靶标

各种胞外或胞内信号直接或通过RIPK1激活RIPK3蛋白。RIPK3介导的磷酸化诱导MLKL膜易位，因此，离子内流导致死亡。生存信号通过上调IAPs或激活TAK1激酶途径阻断RIPK1诱导的信号传导，保护细胞免受不必要的坏死。caspase-8介导的前凋亡RIPK1和RIPK3的切割确保了免疫沉默性凋亡的优势，而非免疫刺激性坏死。

 

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1. RIPK1是一个能与TNFR1相互作用的蛋白因子, 既能参与凋亡调节, 也能参与程序性坏死调节。RIPK1的N末端是激酶结构域, 且激酶区会在丝氨酸/苏氨酸残基位点发生自身磷酸化; C末端为死亡结构域; N末端和C末端之间是一段中间区域, 包含同型作用结构域。RIPK1的3个结构域具有不同的功能:通过N末端的调控激活NF-κB信号途径使细胞存活; 通过C末端的死亡结构域与TNFR1相互作用诱导凋亡; 通过同型作用结构域与RIPK3形成坏死小体参与调节程序性坏死。

2. RIPK3具有RIP同型结构域, 能与RIPK1结合, 是细胞程序性坏死的重要分子开关: 下调RIPK3可阻止细胞程序性坏死, 但不影响细胞凋亡; RIPK3基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞内RIPK1表达正常, TNF-α未能诱导程序性坏死; 用缺乏激酶活性的RIPK3突变体转染细胞也未见程序性坏死的发生。Caspase-8和FADD对程序性坏死具有负性调节作用, 原因可能是caspase-8把RIPK1和RIPK3从复合物Ⅱ中裂解下来, 阻止RIPK1与RIPK3相互作用和相关基因表达, 从而抑制程序性坏死。

3.  MLKL是一种激酶样蛋白, 即N端的4个螺旋束结构域(4HB) 通过2个螺旋接头与C端的假性激酶样区域连接。其中4HB结构域是细胞死亡执行区域, 且与假性激酶区结合保持失活状态。活化的RIPK3使位于MLKL假性激酶区的α螺旋Thr357和Ser358磷酸化, 从而造成结构不稳定, 释放N末端的4HB结构域。MLKL在胞质膜上寡聚化, 造成胞质膜的不稳定或间接下调Ca²⁺或Na⁺离子通道, 升高了胞内渗透压, 导致细胞坏死。此外, MLKL磷酸化形成寡聚体与磷酸肌醇相连, 可使MLKL从胞质移到细胞膜, 直接破坏膜的完整性, 导致细胞坏死。

如何测量坏死性凋亡：（只列出来部分重要靶标）

坏死性凋亡标记物	坏死性凋亡标记物描述	检测方法
RIP 和 RIP3 激酶	含有 RIP 和 RIP3 激酶可引起坏死性凋亡的蛋白复合体	WB、IHC、FC
Phospho-RIP 和 Phospho-RIP3 激酶	RIP 激酶的磷酸化作为坏死性信号转导事件激活的指标	WB、IHC、FC
MLKL	RIP3 下游蛋白靶标	WB、IHC、FC
Phospho-MLKL	MLKL 磷酸化是坏死凋亡细胞的标记物	WB、IHC、FC
Caspase-8	坏死性凋亡的抑制	WB、IHC、FC
炎症因子检测	坏死性凋亡的功能检测	多因子检测
泛素	蛋白修饰	WB、IHC

 

使用RIP (E8S7U) XP® Rabbit mAb （上图）或β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）对HT-29 和T-29 RIPK1 敲除(-/-) 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。HT-29 RIPK1 敲除型细胞由马萨诸塞州波士顿哈佛医学院的Yuan Junying 博士惠赠。

 

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使用MLKL (D2I6N) Rabbit mAb （上图）或Myc-Tag (71D10) Rabbit mAb #2278（下图），对转染空载(-) 转染Myc/DDK 标签的全长人MLKL 蛋白表达载体(hMLKL-Myc/DDK；+) 的293T 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

 

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使用Phospho-RIP (Ser166) (D1L3S) Rabbit mAb（上图）或β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）对未经处理(-) 或经过如下所示的处理组合方法处理的HT-29 细胞进行蛋白质印迹分析：Z-VAD（20 μM，先于其他混合物30 分钟添加；+）、人TNF-α（hTNF-α，20 ng/ml，7 小时；+）、SM-164（100 nM，7 小时；+）和necrostatin-1（Nec-1，50 μM，7 小时；+）。

 

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使用Phospho-MLKL (Ser345) (D6E3G) Rabbit mAb（上图）、总MLKL (D6W1K) Rabbit mAb (Mouse Specific) #37705（中图）或β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）对未经处理的(-) 或经过以下组合处理方法处理的L-929 细胞提取物进行蛋白质印迹分析：Z-VAD（20 μM，先于其他混合物30 分钟添加；+）、Mouse Tumor Necrosis Factor-α (mTNF-α) #5178（20 ng/ml，4 小时；+）、SM-164（100 nM，4 小时；+）和necrostatin-1（Nec-1，50 μM，4 小时；+）。

 

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