4.1 Single-cell suspensions from Mouse intestinal mucosa

产品名称	备注
RMPI 1640培养液
无Ca2+、Mg2+的Hank‘s ’平衡液(HB-SS-CMF)
无 Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液
含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液
percoⅡ细 胞 分 离 液 (17089102)	80% 和40%等渗percoll溶液
Collagenase Ⅷ胶原酶 (abx082504)	1.5g/L
胎牛血清（ Fetal calf serum, FCS ）	10%
Ⅰ型DNA酶（ DNAse Ⅰ） (LS002139)	100kU／L
EDTA，HEPES和DTT
Stain buffer (554658)
筛网过滤 (abs7008,abs7009)	70um，100um

 

1.肠组织片段的制备
颈椎脱臼法处死小鼠，立即取出约7-8cm结肠和回肠组织，置于预冷PBS-/-中，去除脂肪、肠系膜结缔组织及小肠的集合淋巴结；沿肠系膜一侧将肠管纵向剖开，在预冷PBS-/-中轻轻漂洗，直至粪便完全漂洗干净，横向切成约0.5-1.0cm的肠组织片段。

2.肠组织片段的分离和消化 
将肠组织片段移入50ml离心管中，加入5ml分离液，置于恒温振荡箱中，于37℃下震荡(250r/min)15min；置于旋涡混合器上，涡旋30s，将肠组织片段通过100μm尼龙滤网过滤，此时滤液为肠上皮内淋巴细胞和肠上皮细胞；将肠组织片段重新移入50ml离心管中，加入5ml分离液，重复上述震荡、涡旋和过滤步骤；将肠组织片段移入新的50ml离心管中，加入5ml消化液，置于恒温振荡箱中，于37℃下震荡(250r/min)45min；置于旋涡混合器上，涡旋30s，将肠组织片段通过100μm尼龙滤网过滤，收集滤液于15ml离心管中，于4℃下离心(400xg)10min，弃去上清液，此时沉淀包含LPL。 

 

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3.密度梯度离心
将80%等渗percoll溶液4ml铺于新的15ml离心管底部；用40%等渗percoll溶液8ml重悬上述沉淀，充分吹打均匀后铺在80%等渗percoll溶液上，将离心管倾斜180度使液体缓慢沿着管壁加入，两层液体间可见清晰的分界面；在20℃下行零加减速密度梯度离心(500xg)20min；弃去上层液体至剩余体积为7ml，吸出两层界面间的不透明细胞层，移入新的15ml离心管中，加入PBS-/-至体积为15ml，充分混匀后，于4℃下离心(400xg)8min，弃去上清液，用5ml含10%胎牛血清的RMPI 1640培养液重悬沉淀，充分吹打均匀制备细胞悬液。

 

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4.小鼠LPL细胞计数及特性检测
在倒置相差显微镜下观察肠组织的分离及消化情况。采用自动细胞计数仪进行细胞计数及特性检测，计算细胞悬液中总细胞数量，并分析细胞平均直径、细胞平均圆度及细胞结团率。 

5.小鼠LPL细胞活力检测
采用台盼蓝染色法鉴定细胞活力。将0.4%台盼蓝溶液90μl加入至10μl细胞悬液中，充分混匀，于20℃下孵育3min，采用自动细胞计数仪检测，不着色的是活细胞。 

6.小鼠LPL细胞及肠组织形态观察
光镜下，获取的LPL呈圆形，形态均一，悬浮于培养基中，且生长状态良好。分离液处理后上皮细胞层绝大部分脱落，但黏膜固有层保持完整，而消化液处理后黏膜固有层则完全解离。 

7.小鼠LPL细胞数量、活力及特性
采用上述分离方法，共分离10只小鼠的肠道LPL，每只小鼠可获取(5.5±1.7) × 10⁶个LPL，细胞活力＞92%。细胞平均直径为(7.5±0.8)μm，细胞平均圆度为0.93±0.03，细胞结团率为(0.4±0.2)%，见图1。

 

图1 台盼蓝染色法检测获得LPL的细胞数量及活力

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8.小鼠LPL的细胞活率
通过流式细胞仪检测，采用上述分离方法获取的小鼠LPL细胞活率为(94.5±3.2)％。其中左下象限为活细胞，细胞活率为97.4%，提示所分离细胞中凋亡和死亡细胞较少，见图2。

 

图2 Annexin Ⅴ/ PI凋亡试剂盒检测获得 LPL的细胞活率

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