2.1 实验前的准备

在您开始ChIP实验之前，您需要了解靶蛋白的性质，包括以下几个问题：

 

·您的ChIP靶蛋白是组蛋白、转录因子还是辅因子？
·它是否位于细胞核内？在哪些条件下表达？表达量如何？ 
·它是否会发生翻译后修饰？ 
·您的样本是否需要刺激？ 
·它是直接与DNA结合，还是通过蛋白质之间的相互作用？ 
·它是否与染色质紧密相关，如组蛋白？ 
·它的分析是单个位点还是多个位点？

 

ChIP需要表位高度特异的抗体，识别天然染色质状态或可能的交联构象下的蛋白质或感兴趣的修饰残基。若蛋白质靶点和表位与其他蛋白质关联或通过其他方式遮蔽，则比较难开展ChIP。

 

选择合适的ChIP级抗体对您成功地进行ChIP实验而言至关重要，应尽可能选择商品化的ChIP抗体，如果没有商品化的抗体，您可以采取以下步骤选择应用于ChIP的抗体：

 

✓ 优先选择经IP、IHC或ICC验证的抗体，因这些应用可识别蛋白的天然构象；
✓ 在应用于ChIP实验前验证抗体的特异性；
✓ 对候选抗体进行亲和纯化。  

1)    培养的细胞或组织样品

2)    培养基

3)    交联试剂

4)    甘氨酸

5)    细胞裂解试剂

6)    蛋白靶点的特异抗体

7)    对照抗体

8)    与Protein A和/或Protein G结合的磁珠或琼脂糖珠

9)    蛋白酶K

10)   洗涤和洗脱液

11)   琼脂糖电泳的试剂

12)   PCR引物和试剂

在决定每个ChIP反应所需的“染色质对应的细胞量”时，影响因素包括细胞中的可用表位数量，以及抗体的质量(亲和力和特异性)。如果使用高质量的抗体来靶定高丰度的表位，如RNA聚合酶II及一些类型的组蛋白修饰，每个ChIP只用1x10⁴个细胞也能实现成功富集。当抗体并非最佳或每个细胞的表位数很低时，建议增加细胞数量。您应当根据您的抗体性能来缩放细胞数量，以优化相对于非特异对照(正常IgG或阴性位置对照)的最高信噪比。

	对照组	实验组
目的蛋白抗体	4×106cells	4×106cells
阴性对照IgG	4×106cells	4×106cells
阳性对照H3	4×106cells	4×106cells
所需细胞数	1.2×107cells	1.2×107cells

 

组织/细胞	染色质总产率	预期DNA浓度
脾	每25mg组织20至30μg	200-300 μg/ml
肝	每25mg组织10至15μg	100-150 μg/ml
肾	每25mg组织8至10μg	80-100 μg/ml
脑	每25mg组织2至5μg	20-50 μg/ml
心脏	每25mg组织2至5μg	20-50 μg/ml
Hela	每4×106个细胞10至15μg	100-150 μg/ml

 

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ChIP实验可被分为5个主要步骤，想要得到好的ChIP结果，每一步都需要细心仔细。

1)    样本准备：每一个ChIP实验的开展，都离不开样本的选择。 ChIP实验可使用细胞或组织样本，不同的样本对应的起始量也不同。

2)    交联固定：通常进行ChIP实验时，细胞需要经过固定，保证蛋白与DNA的交联。大多数的实验方法都是采用甲醛进行细胞固定，但也有使用不同的固定条件和固定剂。

3)    染色质剪切：制备片段化的染色质通常使用超声法，在一些条件下也会使用酶切法。

4)    免疫沉淀：制备染色质后，下一步是实际的免疫沉淀(IP)步骤。使用的抗体是至关重要的，决定是否使用磁性或琼脂糖珠也是至关重要的。

5)    下游数据分析：ChIP实验最后一步是数据的分析，通常是qPCR或者高通量测序。