当收获组织时,去除样品上不需要的材料,如脂肪和坏死组织。随后可以立即处理并交联组织,或在干冰上冷冻并储存于-80°C以待稍后处理。为获得最佳的染色质产率和ChIP结果,每次进行免疫沉淀法测试时,使用25mg的组织。不同组织类型的染色质产率也不尽相同,并且一些组织在每次免疫沉淀法测试需要超过25mg。
实验步骤
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准备
1)取出并预热200×Protease Inhibitor Cocktail(PIC)和10× Glycine Solution,确保PIC完全解冻;
2)对每25mg待处理组织,制备3ml磷酸盐缓冲液(PBS)+15μl 200×PIC并置于冰上;
3)对于每25mg待处理组织,制备45μl 37%甲醛并置于室温下贮存。
试剂配方
1)所有缓冲液的用量都应按照实验中IP制备物的数量成比例的增加;
2)1X PBS含有10mM Na2HPO4、10mM NaH2PO4、150mM NaCl;
操作步骤-称重
称取新鲜或冷冻的组织样品。每次免疫沉淀法使用25mg组织进行实验,此外还需要含阳性和阴性对照,因此一次实验至少需要75mg组织;
操作步骤-交联
a) 将组织样品置于60mm或100mm培养皿中并用干净的解剖刀或剃须刀片切碎。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解;
b) 将切碎的组织转移至15ml锥形试管;
c) 对于每25mg组织,添加1ml PBS + PIC到锥形试管;
d) 为了使蛋白质与DNA交联,向每1ml PBS + PIC中添加45μl 37%甲醛并在室温下振摇20分钟。甲醛最终浓度是5%;
实验步骤-终止交联
a) 向每1ml PBS + PIC中添加100μl 10×甘氨酸以终止交联并在室温下混合5分钟;
b) 将组织置于台式离心机中,在4℃下以500×g的速度离心5分钟;
c) 移除上清液并用1ml PBS + PIC/25mg组织洗涤一次;
d) 将组织置于台式离心机中,在4℃下以500×g的速度重复离心5分钟;
e) 移除上清液,对于每25mg组织,将组织重悬于1ml PBS + PIC中并置于冰上贮存。样本裂解前在-80°C条件下最多可保存3个月;