选择一种合适的抗体是成功进行ChIP实验不可或缺的。在ChIP实验中使用的抗体应对目的蛋白具有特异性，并对抗原具有较高的亲和力。ChIP或ChIP-seq实验的最佳抗体是经ChIP或ChIP-seq验证的抗体。如果没有针对目的基因的经ChIP验证的抗体，那么次一点的选择是经免疫沉淀验证的抗体。要注意的是，并不是所有经免疫沉淀的抗体都在ChIP中有效，也并非所有经ChIP验证的抗体都在ChIP-seq中有效。此外，抗体在蛋白印迹、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术和IHC等其他应用中验证的程度越高，我们就对抗体性能和特异性更了解从而更容易选择合适的抗体。在验证抗体之后，必须根据经验决定最佳抗体浓度，以及免疫沉淀洗涤条件。
实验步骤
- 1
- 2
-
选择单克隆还是多克隆抗体？
单克隆或多克隆抗体都适用于ChIP。单克隆抗体识别蛋白质靶点上的特定表位。单克隆的优势在于高度特异，非特异结合的倾向较低。此外，单克隆抗体的每个批次更加一致，因为它们克隆性质的可变性低。不过，如果被单克隆抗体识别的表位被遮蔽或在之前的步骤中被改变，如交联，则单克隆抗体将无法分离出您的蛋白质靶点和与其结合的DNA序列。幸运的是，这种遮蔽很少影响单克隆抗体。与之相反，多克隆抗体识别蛋白质靶点的多个表位。因此，即使少数表位因交联而遮蔽，但多克隆抗体可能更有效。不过，因为多克隆识别多个表位，这就增加了非特异结合的可能性。此外，还必须考虑到多克隆群体的特异性可能在免疫过程中随时间而变化，除非在制备或纯化前将所有血清合并，再进行抗体纯化。
无论您为ChIP实验选择单克隆还是多克隆抗体，您都必须根据您的特定分析来优化您抗体的稀释度。如果使用过量的抗体，您在蛋白质靶点的免疫沉淀中会获得成功，但你也会观察到过高的非特异结合或降低的特异信号。相反，如果您使用过少的抗体，靶点的回收率可能会降低。
如果抗体已经过ChIP验证，请参考抗体产品说明书以得到每次IP所需的正确抗体量。与SimpleChIP®试剂盒配套使用时，所用的稀释度可从“建议抗体稀释度”中获得，而验证实验中使用的抗体的准确体积和染色质的量会在抗体产品说明书的“染色质免疫沉淀”附图说明中提供。在CST验证抗体时，经常以4x106细胞(10–20μg染色质)来确定最优的稀释度。
-
CHIP的对照抗体
染色质是一种由蛋白质与核酸结合而成的复杂混合物。为了确保有效的结果，ChIP实验应当包含对照以消除染色质和抗体的非特异性结合，免疫沉淀磁珠，以及ChIP实验获得的DNA用于分析。为了控制您的ChIP抗体的特异性，您应当在ChIP实验中包含以下对照：
阴性对照抗体：使用与您的ChIP抗体有着相同物种和形式(如纯化的naïve血清，或腹水)的阴性对照IgG。例如，如果您使用正常的纯化的小鼠单克隆ChIP抗体，则使用正常的纯化小鼠IgG作为您的阴性对照。如果您使用纯化的兔多克隆ChIP抗体，则使用正常的纯化的兔IgG作为阴性对照抗体。或者，如果没有适当的阴性对照IgG，您可以选择使用“无抗体”或只有磁珠的方法。尽管匹配的IgG通常是更好的阴性对照，但阴性对照IgG或只有磁珠的对照也可用于富集倍数的计算。
阳性对照抗体：使用相同物种的抗体，它们能识别高丰度的蛋白质靶点，如RNA聚合酶II或组蛋白亚(通常是H3或H4 N端)。阳性对照抗体有助于验证除ChIP抗体选择外的其他影响实验的因素，并对故障排除很有帮助。