在您选择抗体之前,必须了解抗体的特异性。在使用针对翻译后修饰的蛋白质(如修饰的组蛋白)的抗体时,尤其是这样。您必须确认所使用的抗体只检测包含特定修饰位点的表位。
目前有多种方法来评估抗体的特异性,包括斑点杂交、多肽芯片或多肽抑制分析。一些实验室将开展多种验证方法,特别是对修饰的组蛋白肽段,以便正确评估与相似表位的交叉反应性,例如同一个组蛋白亚基上的二甲基和三甲基加合物。
关于检测组蛋白抗体特异性的可靠方法,默克密理博建议使用AbSurance™组蛋白抗体特异性芯片(货号16-665、16-668和16-667)。这些芯片在PVDF膜上总共提供了89个组蛋白H2、H3和H4的高质量肽段。分析操作像Westernblot一样简单,使用标准的化学发光检测系统,而需要其他的软件或昂贵的设备进行检测。
实验步骤
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实验建议
1)分析至少2个已知阳性和1个已知阴性的靶标位点的免疫富集情况,以确定抗体特异性。与已知阴性靶标位点相比,抗体对已知阳性位点必须显示最小富集倍数;使用CST的专有组蛋白肽阵列,进一步分析组蛋白甲基赖氨酸和甲基精氨酸抗体的抗体特异性;
2)使用CST的专有组蛋白肽阵列,进一步分析组蛋白甲基赖氨酸和甲基精氨酸抗体的抗体特异性;
3)在抗体与同型对照比较中,分析已知靶标位点免疫富集的信噪比来确定抗体敏感性。抗体必须显示一个预先确定的最小信噪比,即靶标特异性抗体超过同型对照的靶标位点处最小可接受的富集倍数;
4)在ChIP实验中,对每种抗体进行滴定来确定最佳性能。抗体太少或太多都不利于靶标位点的免疫富集;
5)通过滴定新批次与前一批次来确定批间可重复性;
6)使用已知阳性与阴性及野生型与敲除型细胞系来评估抗体特异性;
7)使用能诱导胞核定位和/或与靶基因结合的细胞处理法来评估抗体特异性;
8)在多种应用中测定抗体性能,以增强最终用户对抗体特异性的信心。