qPCR简介
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实验建议
在您完成ChIP并纯化您的DNA样品之后，您可选择开展终点或实时定量PCR(qPCR)，以定量您样品中的DNA。在qPCR中，您的DNA样品与引物、聚合酶、寡核苷酸及检测荧光基团，如TaqMan®(荧光报告基团:淬灭基团杂合体)特异探针或SYBR® Green嵌入染料(无需特异探针)共同孵育。DNA样品通过DNA聚合酶经历数个扩增循环，其中上个循环的产物成为下个循环的模板，因此在最理想的反应中，扩增的DNA在每个循环中倍增。qPCR分析让您能够通过分析与扩增子的量成正比的荧光信号强度，实时定量多个样品中的起始DNA浓度。为了实现成功的ChIP分析，确保您的引物能以95%以上的效率扩增目的序列，且它们不会形成二聚体，这些二聚体有可能减弱基于SYBR® Green技术的qPCR的特异信号。
两种常用的qPCR检测方法是SYBR® Green技术和TaqMan®探针技术。SYBR® Green是一种DNA结合染料，在与双链DNA结合时荧光显著增强。因此，当双链DNA的拷贝数增加时，荧光信号也增加。检测也可通过TaqMan®探针来实现。在这种方法中，荧光报告基团和荧光淬灭基团被掺入单个序列特异的探针中，此探针能识别您的PCR扩增子。对于游离的探针，报告基团的信号因淬灭基团的邻近而淬灭。一旦与扩增子杂交，DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性将降解探针，释放出与可杂交的模板分子的数量成正比的游离荧光基团。在上述两种qPCR技术中，荧光信号都先经历线性期，而在反应中的一个组分成为限速时到达平台期。
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荧光信号指示每个样品的循环阈值(Ct)*。Ct值指的是线性期中荧光信号超过背景的点。Ct取决于您样品中DNA的量。如果您的样品含有相对大量的DNA靶点，则需要较少循环就能超过背景，那么Ct值低。相反，如果您的DNA靶点量较低，则实现Ct需要更多的循环。通过qPCR开展ChIP分析时，最好使用更稀的DNA样品(而不是高度浓缩的模板，因为高浓度存在时，它可能会抑制Taq聚合酶)。因此，按照现有方案中通过qPCR分析ChIP DNA的典型量，如50μL ChIP样品中取2μL，以避免向反应中引入PCR抑制剂。
*注意：目前的MIQE(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-TimePCR Experiments)指南建议在报告qPCR数据时，应以“定量循环”(Cq)来取代“循环阈值”(Ct)。