准备
取出并预热200×Protease Inhibitor Cocktail(PIC)，使用前确保它完全融化。
试剂配方
1) SimpleChIP®或SimpleChIP®Plus试剂盒：
a) 配制1MDTT(192.8mg DTT+1.12 mld H2O)，确保DTT晶体完全溶解；
b) 对于每份IP制备物，制备1ml 1×缓冲液A(250μl 4×BufferA + 750μl水) + 0.5μl 1MDTT+5μl200×PIC并置于冰上；
c) 对于每份IP制备物，制备1ml1×缓冲液B(275μl 4×BufferB + 825μl水) + 0.55μl 1MDTT并置于冰上。
2) 如果自己配置缓冲液，配方如下：
a) 裂解缓冲液：
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试剂 |
储液 |
含量（每60mL） |
终浓度 |
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HEPES (pH 7.5) |
1mol/L |
3mL |
50mmol/L |
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NaCl |
5mol/L |
1.68mL |
140mmol/L |
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EDTA (pH 8.0) |
0.5mol/L |
120μL |
1mmol/L |
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甘油 |
100% |
6 mL |
10% |
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NP-40 |
100% |
3 mL |
0.5% |
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Triton X-100 |
100% |
0.15mL |
0.25% |
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dH2O |
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46.05mL |
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b) 蛋白质提取缓冲液：
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试剂 |
储液 |
含量（每50mL） |
终浓度 |
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NaCl |
5mol/L |
2mL |
200 mmol/L |
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EDTA (pH 8.0) |
0.5mol/L |
100μL |
1mmol/L |
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EGTA (pH 8.0 |
0.5mol/L |
50μL |
0.5 mmol/L |
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Tris (pH 8.0) |
1mol/L |
500μL |
10 mmol/L |
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dH2O |
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47.35mL |
实验步骤
- 1
- 2
- 3
- 4
- 5
- 6
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重悬
对于每份IP制备物，将细胞重悬于1ml冰冷的1×缓冲液A + DTT + PIC中；
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孵育
在冰上孵育10分钟，每3分钟颠倒试管混匀；
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离心
将细胞置于台式离心机中，在4℃下以2,000×g的速度离心5分钟从而沉淀胞核；
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重悬
对于每份IP制备物，移除上清液并将沉淀物重悬于1ml冰冷的1×缓冲液B + DTT中；
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离心重悬
对于每份IP制备物，重复离心，移除上清液并将沉淀物重悬于100μl1×缓冲液B + DTT；
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转移
将样品转移至5ml微量离心管，直至每支试管共装有1ml样品。