将交联的染色质DNA消化成150-900个碱基对长度的最佳条件高度取决于Micrococcal Nuclease对消化中所用组织量或细胞数目的比率，因此需要进行确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的预实验。
准备
取出并预热200×Protease Inhibitor Cocktail(PIC)，使用前确保它完全融化。
试剂配方
1) SimpleChIP®或SimpleChIP®Plus试剂盒：
a) 配制1MDTT(192.8mg DTT+1.12 mld H2O)，确保DTT晶体完全溶解；
b) 对于每份IP制备物，制备1ml 1×缓冲液A(250μl 4×BufferA + 750μl水) + 0.5μl 1MDTT+5μl200×PIC并置于冰上；
c) 对于每份IP制备物，制备1ml1×缓冲液B(275μl 4×BufferB + 825μl水) + 0.55μl 1MDTT并置于冰上。
2) 如果自己配置缓冲液，配方如下：
a) 裂解缓冲液：
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试剂 |
储液 |
含量（每60mL） |
终浓度 |
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HEPES (pH 7.5) |
1mol/L |
3mL |
50mmol/L |
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NaCl |
5mol/L |
1.68mL |
140mmol/L |
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EDTA (pH 8.0) |
0.5mol/L |
120μL |
1mmol/L |
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甘油 |
100% |
6 mL |
10% |
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NP-40 |
100% |
3 mL |
0.5% |
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Triton X-100 |
100% |
0.15mL |
0.25% |
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dH2O |
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46.05mL |
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b) 蛋白质提取缓冲液：
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试剂 |
储液 |
含量（每50mL） |
终浓度 |
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NaCl |
5mol/L |
2mL |
200 mmol/L |
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EDTA (pH 8.0) |
0.5mol/L |
100μL |
1mmol/L |
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EGTA (pH 8.0 |
0.5mol/L |
50μL |
0.5 mmol/L |
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Tris (pH 8.0) |
1mol/L |
500μL |
10 mmol/L |
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dH2O |
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47.35mL |
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实验步骤
- 1
- 2
- 3
- 4
- 5
- 6
- 7
- 8
- 9
- 10
- 11
- 12
- 13
- 14
- 15
-
转移
将100μl胞核制备物转移入5个独立的5ml微量离心管中，然后置于冰上；
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加试剂
向27μl 1×缓冲液B + DTT(1:10酶稀释度)中添加3μl Micrococcal Nuclease原液；
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混合
向步骤2中5支离心管的每支试管中添加0μl、5μl、5μl、7.5μl或10μl稀释的Micrococcal Nuclease，翻转离心管数次进行混合，然后在37°C下孵育20分钟，同时频繁混合；
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终止消化
添加10μl 0.5M EDTA并将离心管置于冰上以终止消化；
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离心
置于微量离心机中，在4℃下以16,000xg离心1分钟，使胞核沉淀，并移除上清液；
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重悬孵育
将胞核沉淀物用200μl 1×ChIP缓冲液 + PIC重悬。在冰上孵育10分钟；
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孵育
用几个脉冲对裂解物进行声波处理以破坏胞核膜，脉冲间期，将样品置于湿冰上孵育30秒；
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观察
在光学显微镜下观察声波处理前后的胞核，确定完全裂解胞核所需的最佳条件；
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裂解
通过使用设置为6且配有1/8英寸探头的VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator，Hela胞核在3组20秒的脉冲之后完全裂解；或者，可以通过将裂解物置于Dounce匀浆器中搅匀20次，裂解胞核，但是裂解可能不完全；
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离心
在4°C下用微量离心机以9,4000×g的离心力离心分离10分钟来使裂解物变澄清；
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转移
从每份超声处理的裂解物中取出50μl转移至新的微量离心管；
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涡旋混合
向每份50μl的样品中添加100μl无核酸酶水、6 μl 5M NaCl 和2μl RNAse A，涡旋混合并在37°C下孵育 30 分钟；
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涡旋混合
向每份RNAse A消化的样品中添加2μl Proteinase K。涡旋混合并在65°C下将样品孵育2小时；
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电泳
从每份样品取出20μl，使其与100 bp DNA 标准品在1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定DNA片段大小；
-
观察结果
观察哪个消化条件能够产生所需150-900碱基对(1至5个核小体)范围内的DNA。优化实验步骤中能够获得所需DNA片段大小的Micrococcal Nuclease的稀释体积等于需添加至一份免疫沉淀制备物(25 mg 离散的组织细胞或4 × 106个组织培养细胞)以获得所需DNA片段大小的Micrococcal Nuclease原液体积的10倍。例如，如果在这个实验步骤中，5μl稀释的微球菌核酸酶产生 150-900 碱基对的DNA片段，则应当在第III部分中染色质消化期间添加5μl微球菌核酸酶原液至一份IP制备物。
如果结果表明DNA的大小未在所需的范围内，则重复优化实验步骤，每次消化中相应调节Micrococcal Nuclease的量；或者，可以改变消化时间以提高或降低DNA片段化的程度。