为了从您的qPCR分析中提取出有意义的信息，您必须测定某些参数，以确保分析本身是正常工作的。首先，检测您qPCR反应的效率(E)。qPCR反应的效率通常以百分比表示，这表示每个循环中被扩增模板的百分比。检测您反应效率的最佳方法是建立标准曲线，通过运行已知浓度样品的五点连续稀释，并将相应的Ct值作图以建立标准曲线。
对于qPCR优化实验中所用的DNA标准品，您可以使用片段化、已纯化的基因组DNA，或更方便的是，使用分离自染色质、作为起始样品的DNA。这个起始样品在您的总染色质样品中占很小的比例(2-5%)。染色质样品应经过蛋白酶K消化，解交联，并经过纯化，以便为分析开发或效率计算提供一个适当的对照材料。在qPCR仪器的软件中，如果您的样品类型选为“标准”，效率通常是自动计算并报告的。
实验步骤
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反应效率可通过以下公式来计算：
Ef ‑ ciency (E) =10-1/标准曲线的斜率
% Ef ‑ ciency = (E-1) x 100
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对于一个精心优化的反应，效率应介于95-105%。如果您的效率落在此范围之外，您可能需要探究实验中可能的误差来源：
1) 运行每个稀释度的至少三次重复，并调整您的稀释度
2) 使用经过优化的缓冲液
3) 使用精心设计的引物 – Ct值最好在18-30之间。
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如果您的效率仍不是最佳，考虑下列可能的原因：
a.扩增子太大(使其长度保持在65-150bp）
b.引物完整性差(使用新鲜的引物)
c.引物浓度太高(改变引物稀释度以避免二聚体)
d.模板DNA中存在苯酚、盐或乙醇的污染
e.仪器的基线或阈值设置不当
f.无模板对照的污染(使用专门的移液器、UV照射过的仪器、新鲜的Milli-Q®纯水等，在单独的空间建立反应）