9.2.2 qPCR操作步骤

标记适当数量、兼容待用PCR仪型号的PCR管或PCR平板。PCR反应应当包括阳性对照组蛋白H3样品、阴性对照Normal Rabbit IgG样品、监控DNA污染的不含DNA模板的试管和2%输入对照组染色质DNA的连续稀释物(未稀释、1:5、1:25、1:125)，以生成标准曲线并测定扩增效率

向PCR平板上的每只管或每个孔中添加2 μl相应的DNA样品；

按下文所述的步骤制备主反应混合物。额外足量配置两个反应的试剂以弥补分管时的体积损失。向每支PCR反应管或每个孔中添加18μl反应混合物。如有必要用铝箔纸盖住平板以避光，并在4°C下最多保存4小时或在-20°C下过夜，直到机器可以使用；

a.预变性:95℃ 3分钟

b.变性:95℃ 15秒

c.退火:60℃ 60秒

d.重复步骤b和c，共循环40次。

 使用实时PCR仪的自带软件，分析定量PCR结果。或者，可以使用input样品百分数方法和以下所示的公式，手动计算IP效率。采用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总input样品染色质的百分比；

输入百分比 = 2% x 2（C[T] 2% 输入样品 – C[T] IP 样品） C[T] = CT = PCR 反应的阈周期