9.2.3 qPCR数据分析

绝对定量能确定特定数量的样品中有多少DNA，而不需要与其他样品进行比较分析。对于这种分析，您应当开展以下操作：

1)    准备已知浓度样品(已定量、已纯化的起始DNA)的连续稀释

2)    每个稀释度至少包括三次重复

3)    与您的待测样品一起运行这些标准品

4)    将样品的log值与qPCR分析所获得的Ct值作图，建立标准曲线

5)    开展回归分析，以确定标准曲线的方程，并利用此方程来计算未知样品的DNA量

6)    待测样品中DNA目标的量应落在qPCR分析的线性动态范围。如果情况并非如此，须调整标准样品的稀释度，并重复实验。

7)    根据外推Ct测定所得到的拟合值可报告为“回收的DNA纳克值”、“起始百分比”、“拷贝数”、“平均量”，以及描述分子数量的其他变型。在使用起始DNA作为相对标准曲线法的标准品时，“起始百分比”最为常用。

 

在相对定量分析中，待测样品是以相对于对照样品(利用纯化的正常IgG免疫沉淀或mock IP)的倍数变化来表示的。待测样品也可表示为参考基因的百分比，此基因已知在实验条件下维持恒定的表达水平，类似于Western blot分析中的“看家”蛋白质，或qRT-PCR表达分析中的看家基因cDNA。

 

已知未被免疫沉淀蛋白质占据的DNA位点(阴性位点)可作为这种方式中的参考基因，相对于已知、被占据的阳性对照DNA位点。

 

∆Ct方法

其中E=2:

ChIP DNA/对照DNA的比例 = 2 Ct(control DNA)-Ct(ChIP DNA)

 

2-∆∆Ct方法

当利用相同数量的细胞来获得对照和待测DNA样品时，可使用∆Ct方法。

 

这种方法被广泛用于以起始DNA来标准化ChIP DNA，分析包括阳性和阴性位点的引物，且扩增效率相同。起始DNA指的是在免疫沉淀之前获得的染色质样品。ChIP DNA和稀释的起始DNA同时分析，以产生各自的Ct值。为了计算ChIP DNA相对于起始样品的富集倍数，完成下列步骤：

 

1)    对于每对引物，用ChIP DNA的Ct值减去起始DNA所获得的Ct值，以起始DNA的Ct值来标准化ChIP DNA的Ct值(∆Ct)：

∆Ct = CtChIP DNA – (Ctinput - Log2 [Input dilution factor])

2)    计算每个ChIP的起始百分比：%Input = 2(-∆Ct [normalized ChIP])

3)    用阳性位点的∆Ct值减去阴性位点的∆Ct值，以阴性位点来标准化阳性位点的∆Ct值(∆∆Ct)：(∆∆Ct = ∆Ctpositive – ∆Ctnegative)

4)    计算ChIP DNA中阳性位点序列相对阴性位点的富集倍数：

Fold enrichment =2^-∆∆Ct