交联染色质DNA碎裂的最佳条件高度依赖于使用的细胞数量、样品体积、超声处理时长和超声波仪功率设置。对于每份声处理样品,CST建议每1ml ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer使用100-150mg组织或1×107-2×107个细胞。 以下是确定某种特定组织或细胞类型的最佳超声处理条件的实验步骤。
实验步骤
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超声
通过超声处理碎片化染色质对于指定超声波仪,可以通过在规定功率设置下改变超声处理循环次数或时长来确定最佳超声处理条件。要确定最佳超声处理条件,设计一项超声处理时程实验,并在某个超声处理循环或时长后取出50µl染色质样品。例如,每1-2分钟超声处理后取出染色质样品;
离心
在4°C下用微量离心机以21,000×g的离心力离心分离10分钟,使染色质样品变澄清;
孵育
将上清液转移到新微量离心管中,并加入100µl无核酸酶水、6µl 5M NaCl和2µl RNAse A,涡旋混合,并在37℃下孵育样品30分钟;
孵育
向每份经RNase A消化的样品添加2μl Proteinase K,涡旋混合并在65℃下孵育样品2小时;
取出DNA
从每份样品中取20 µl,并确定DNA片段大小;
优化条件
选择能产生最佳DNA片段大小的超声处理条件,用于后续的染色质制备;如果未达到最佳超声处理条件,则增加或减少超声波仪的功率设置,并重复超声处理时程。