5.3 染色质的制备 实验TIPS

1）细胞裂解的缓冲液配置时，要注意一旦配制在溶液中，须将1M DTT置于-20℃下存放。

 

2）用酶消化染色质时，为了获得最佳的ChIP结果，适宜大小和浓度的染色质非常关键。染色质过度消化可能会在PCR定量时削弱信号，染色质消化不充分可能导致背景信号增加和分辨率降低，向IP中添加染色质过少可能导致在PCR定量时信号削弱。

 

3）一次染色质制备量规定为100-150mg组织或1×10⁷- 2×10⁷个组织培养细胞；可以同时进行多份染色质制备，只要相应增加缓冲液用量并对1ml样品进行超声处理；超声处理所使用的细胞数量和样品量对于产生合适大小的染色质片段非常关键。

 

4）最佳超声处理条件根据样品类型和固定时间而不同。使用产生所需长度染色质片段需要的最少超声处理循环次数，超过80%短于500bp的总DNA片段表明，过分超声处理会导致染色质过度受损，并会降低免疫沉淀效率。

 

5）重复已发表的剪切方案而无需优化可能颇具挑战性。当您的仪器不同于那些方案中所使用的仪器时，尤其如此。目前有各种超声破碎仪器，水浴和基于探头的。在使用基于探头的超声破碎仪时，选择一个适用于您的样品体积的探头。在任何情况下，剪切参数都应当根据您的样品体积、细胞密度和细胞类型而优化。

 

6）优化应当包括功率设置(超声时间vs. 间隙时间/休息时间)以及获得长度为200–1000bp的DNA片段所需的剪切循环数。这个大小很重要，因为下游分析通常只检测大小为100–200bp的扩增子，包含一个感兴趣的结合位点。为了成功优化，每个优化实验只优化一种参数；例如，让功率设置保持不变，而改变循环数。

 

7）超声破碎的效率也因每种细胞类型以及细胞数量而不同。对于不同的细胞或组织类型，您需要开展单独的优化。

 

8）注意时间和功率设置。过度破碎和太高功率设置会损害您用在免疫沉淀步骤中的表位。这将降低您的ChIP信号。

 

9）始终保持裂解液冰冷，并间断超声，而不是连续，因为超声处理产生热量，会使染色质变性。在超声破碎过程中避免气泡。泡沫会导致蛋白质的表面变性，可能使染色质损失在气泡中。为了避免这种情况，一开始设为较低功率，再逐步提高。

 

10）在优化条件时，每个超声破碎循环后通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的长度。为了获得最佳的大小，您应当开展额外的纯化步骤，以便在电泳前纯化DNA。剪切不足所产生的大的不溶蛋白质:DNA:RNA复合物可能堵塞琼脂糖凝胶的孔，并延缓电泳过程。通过消化蛋白质、逆转交联、酚:氯仿提取和沉淀来纯化DNA。

 

注意：异染色质可能耐受超声破碎，这可能会降低染色质的产量。