ChIP抗体可直接与琼脂糖或磁珠相结合,也可固定在与蛋白A和/或蛋白G结合的磁珠上。最早的ChIP操作使用琼脂糖珠,琼脂糖微球是用于免疫沉淀的传统珠子,优点是价格便宜,但是样本需离心,时间长,而且珠子在离心过程中可能破裂。琼脂糖珠存在非特异性结合,因此需要“预先清洗”染色质,除去可能与蛋白G琼脂糖非特异性结合的蛋白质或DNA。另外分层不明显,样品容易丢失。
相比较而言,磁珠能够从粗制的染色质混合物中快速分离蛋白质/DNA复合物,不需要离心,样品不容易丢失,洗得更彻底,虽然价格稍微贵一些,但使用更简便,目前已成为主流选择。
磁珠可应用于ChIP测序实验,因为它们不会被DNA所封闭。琼脂糖微珠会被经过超声的鲑鱼精子DNA所封闭而减少背景信号,当进行高通量测序时任何封闭DNA的过载都会影响序列读取。
共沉淀实验TIPS
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实验TIPS:
1)所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。
2)对于大部分Cell Signaling Technology抗体,添加1和2ug到每份IP样品中效果最佳。当存在多份不同浓度的样品时,最好使阴性对照Normal Rabbit IgG与最高抗体浓度相匹配。
3)ChIP-Grade Protein G Agarose Beads使用经超声处理的鲑精DNA封闭,故不可用于ChIP-Seq实验。