4.1 稳定蛋白质与DNA的体内结合

染色质免疫共沉淀通常包括2种类型: 交联免疫共沉淀(cross-linked ChIP, X-ChIP)和无交联免疫共沉淀(native ChIP, N-ChIP)。

 

X-ChIP一般采用甲醛作为可逆的交联剂，由于甲醛固定增强了DNA与蛋白质的结合程度, 降低了蛋白质重排的可能性, 因此X-ChIP的灵敏度较高, 适用于转录因子等与DNA结合程度不是很强的蛋白质研究。

 

在某些情况下，蛋白质靶点已与DNA紧密结合，那么在实验分析过程中，就不需要其他的化学交联，来保留蛋白质/DNA复合物。这被称为native ChIP，或N-ChIP。N-ChIP适用于与DNA结合紧密的组蛋白修饰的表观遗传学研究; 同时, 由于抗体与未固定的目标蛋白质结合程度高, 因此N-ChIP的特异性较强, DNA富集效率高。虽然这些优势使得N-ChIP成为一种颇具吸引力的方法，但它只能用来检测组蛋白。此外，在染色质消化和免疫沉淀步骤期间，蛋白结合丢失可能会使数据出现偏差，或妨碍适当分析。然而，值得注意的是，没有额外交联，核小体上的体内修饰在分析过程中仍时有发生。

 

在靶定与DNA结合较弱的蛋白质时，默克密理博建议使用交联ChIP(X-ChIP)的方案。X-ChIP可利用紫外光、甲醛或其他的化学交联剂开展。 对于活体样品制备，甲醛交联通常是首选，因为这种修饰是可逆的，能分离并扩增ChIP富集的DNA。此外，甲醛的交联距离只有2Å(0.2 nm)，确保您交联的是已经与DNA紧密结合的蛋白质。甲醛也将在DNA结合蛋白和与之相结合的蛋白之间形成交联，有助于蛋白质/DNA间接相互作用的研究。甲醛交联能够承受后续的实验操作，让您能分离出完整的蛋白质/DNA复合物。不过，甲醛有时候会产生非特异的交联。

 

交联固定步骤仅针对X-ChIP。