6.1 使用适当的抗体从染色质提取物中分离蛋白质靶点/DNA复合物

使用抗体来捕获目的蛋白及其结合的DNA。抗体浓度应根据经验决定，一般起始点为每10μg染色质DNA(相当于约4×10⁶个细胞)使用0.5-2.0μg抗体。缓冲液和洗涤次数的严格程度也应根据经验确定，因为它们会决定抗体对其靶标抗原的亲和力。通常，抗体-染色质孵育要2小时至过夜才能完成。

 

抗体-抗原(+DNA)复合体在抗体结合树脂上根据亲和力进行捕获。在ChIP实验中，这种树脂通常包含偶联蛋白G的ChIP级磁性、球状琼脂糖或琼脂糖珠子。抗体结合蛋白A和/或蛋白G珠子的亲和力不同，具体取决于产生抗体的物种以及其重链的IgG亚型。珠子通常用抗体-染色质孵育2-4小时。

 

需要洗涤步骤来去除不结合抗体的染色质，随后解除交联(针对X-ChIP)并进行DNA纯化。此外，必须进行IgG对照免疫沉淀，以确定背景(信噪比)。还必须加入阳性对照抗体(即总组蛋白H3)和/或阳性对照qPCR引物(针对已知的阳性和阴性靶蛋白结合位点)，以确定非特异性结合。为获得最佳结果，必须通过qPCR对染色质免疫沉淀进行质控，之后再进行下游 NGS分析。

 

以下操作步骤都是基于SimpleChIP^®或SimpleChIP^®Plus试剂盒。