以下部分内容引用自 BD
微球免疫分析系统CBA (Cytometric Bead Array)CBA是种结合流式细胞仪荧光检测和微球免疫分析的应用技术,可以轻松地在短时间内, 同时检测多种蛋白。其作用原理利用荧光强度不同的微球,上面带有可以辨认特定蛋白的抗体( captureantibody),与样本(例如血清、血浆、培养上清液、细胞裂解液等)及PE检测抗体(detectionantibody)作用后以流式细胞仪进行分析。根据PE荧光强度的不同用FCAP Array软件进行分析和标准品做比对后,可进行样本内特定,蛋白的定性或定量。
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CBA具有以下优点:
| 样本量少 灵敏度高 | 实验步骤简便 | 弹性设计实验 | 结果分析容易 |
| 每次检测仅需25-50ul样本;灵敏度可达0.274pg/ml | 时间快速，仅需3-4小时，快速上样 | 最多可同时测定 30 种蛋白,实验可重复性高 | 利用 FCAP Array 软件，不论样本数目多少，可快速分析完成分析 |
实验步骤
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操作流程以人Th1/Th2/Th17细胞因子检测试剂盒(货号:560484)为例
标注 试剂 容量 A1 捕获微球 Human IL-2 Capture Beads 1瓶，0.8ml A2 Human IL-4 Capture Beads 1瓶，0.8ml A3 Human IL-6 Capture Beads 1瓶，0.8ml A4 Human IL-10 Capture Beads 1瓶，0.8ml A5 Human TNF Capture Beads 1瓶，0.8ml A6 Human IFN-γ Capture Beads 1瓶，0.8ml A7 Human IL-17A Capture Beads 1瓶，0.8ml B 检测抗体 Human Th1/Th2/Th17 PE Detection Reagent 1瓶，4.0ml C 标准品 Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Standards 2瓶，0.2ml 冻干粉 D 仪器调校微球 Cytometer Setup Beads 1瓶 , 1.5 mL E1 PE阳性对照 PE Positive Control Detector 1管 , 0.5 mL E12 FITC阳性对照 FITC Positive Control Detector 1管 , 0.5 mL F 洗液 Wash Buffer 1瓶 , 130 mL G 稀释液 Assay Diluent 1瓶 , 30 mL H 血清增强液 Serum Enhancement Buffer 1瓶 , 10 mL -
试验流程总览
步骤 描述 所需时间 1 制备Th1/Th2/Th17细胞因子标准品(Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Standards) 15分钟 2 混合Th1/Th2/Th17细胞因子捕获微球(Capture Beads) 10分钟 3 捕获微球、样本、检测抗体混合后共孵育 3小时 4 仪器调校微球调节流式细胞仪条件设置（操作说 明详见www.bdbiosciences.com/cbasetup） 15分钟 5 清洗捕获微球/样本/检测抗体复合物 15分钟 6 上机检测 约30样本 7 数据分析（FCAP v3.0） 10分钟 -
配套试剂
CBA具有以下优点:除BD CBA人Th1/Th2/Th17细胞因子检测试剂盒提供的试剂外，还需要以下产品：
1) 流式细胞仪: 需配有488 nm/532 nm激光器和633 nm/635 nm激光器，可以检测576 nm、660 nm及大于680 nm发射光的流式细胞仪。下表列举了部分可用于CBA检测的流式细胞仪。仪器型号 报告参数 分群参数 BD FACSVerse flow cytometer PE CBA Red BD Accuri C6 flow cytometer FL2 FL4 BD FACSArrayTM bioanalyzer Yellow Red BD FACSCanto II flow cytometer
PE
APCBD LSRFortessa flow cytometer BD FACSAria III cell sorter BD FACSCalibur flow cytometer （单激光） FL2 Fl3 BD FACSCalibur flow cytometer （双激光） Fl4 2) 12×75 mm BD Falcon™流式上样管或同类产品。
3) 15 ml聚丙烯圆锥底离心管或同类产品。
4) CBA分析软件：FCAP Array软件 (PC机版本：641488 / Mac版本：645447)。
5) BD Calibrite™3色微球（货号：340486）。
6) BD Calibrite™APC 微球（货号：340487）（双激光BD FACSCalibur 机器使用）。 -
实验操作
1). 制备细胞因子标准品
1) 将一瓶冻干的细胞因子标准品小球转移至15ml锥形离心管中，标记为最高浓度标准品（5000pg/ml）；
2) 用2ml Assay Diluent 稀释标准品，室温平衡至少15分钟；
3) 用枪头轻柔混匀标准品，不要涡旋或剧烈振荡混匀；
4) 取9支12x75mm流式管，分别标记梯度稀释倍数1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256；
5) 每管加入300μl Assay Diluent；
6) 从最高浓度标准品开始逐个加入300μl倍比稀释液，梯度稀释标准品，如下图所示：(从最高浓度标准品管取300μl溶液至1：2管，吹打混匀，随后从1：2管取300μl溶液至1：4管吹打混匀，依此类推，直至1：256管)；
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7) 最后取1支12x75mm流式上样管中加入300μl Assay Diluent作为阴性指控管（0pg/ml）。
2). 混合细胞因子捕获微球a 混合微球
a) 确定实验样本数（含所有标准品、阴性对照及检测样本），如8个待测样本，9个标准品，1个阴性对照，共计18管。
b) 混合前每种捕获微球需vertex充分涡旋5-15秒（此步骤是整个实验的关键，为保证微球数量充足，建议每吸取一种微球之前充分混匀此微球溶液）。
c) 按照10μl/样本吸取适量的捕获微球，如样本数为18，则每种细胞因子捕获微球的量为180μl；将所有微球混合于一支流式管中，标记为"混合微球"。
d) 充分涡旋混匀。b 重悬微球
a) 如待测样本为血清或血浆，必须做此步骤。其他类型样本，此步骤可选做。
b) 将混合好的捕获微球室温200g，离心5分钟；
c) 小心吸取上清，加入与步骤1）中"混合微球"相同体积的血清增强液，涡旋混匀；
d) 室温避光孵育30分钟（随后直接作为"混合微球"与样本共孵育）。
3). 样本孵育1-1 充分涡旋重悬好的"混合微球"，每个实验管加入50μl；
1-2 标准品与待测样本；
a) 标准品管中每管加入50μl梯度稀释好的标准品，标准品浓度如下表所示：管号 浓度（pg/ml) 稀释倍数 1 0 未稀释(Assay Diluent) 2 20 1:256 3 40 1:128 4 80 1:64 5 156 1:32 6 312 1:16 7 625 1:08 8 1250 1:04 9 2500 1:02 10 5000 最高浓度标准品 1-3 所有实验管中加入50μl PE标记的细胞因子检测抗体；
1-4 室温避光孵育3小时。
4). 上机检测
1) 每管加入1ml洗液清洗样本，200g 离心5分钟；
2) 小心吸去或轻柔倒掉上清液，每管加入300μl洗液重悬细胞；
3) 仪器调校完毕后尽快上机检测（为避免标准品及待测样本中细胞因子降解，建议尽快上机检测，如有拖延将样本置于冰上，但不可过夜）。
5). 数据分析
样本收集完毕（FCS2.0格式）后，用CBA专用分析软件FCAP Array v3.0进行标准曲线绘制及数据分析。