6.1 CBA Flex Set操作流程

步骤	描述	所需时间
1	制备人可溶性蛋白自由组合试剂标准品	15分钟
2	混合人可溶性蛋白自由组合试剂捕获微球	15分钟
3	制备人可溶性蛋白自由组合试剂PE标记检测抗体	15分钟
4	人可溶性蛋白自由组合试剂与样本孵育	1小时+2小时
5	仪器调校微球调节流式细胞仪条件设置（操作说 明详见www.bdbiosciences.com/cbasetup）	15分钟
6	清洗微球/样本/检测抗体复合物	15分钟
7	上机检测	约30S样本
8	数据分析（FCAP Array v1.0）	15分钟

除了在人可溶性蛋白自由组合溶液试剂盒里所提供的试剂外，还需要以下产品：

1) 流式细胞仪：配有双激光，配有488 nm或532 nm激光器和633 nm或635 nm激光器，可以检测576 nm、660 nm及大于680 nm发射光的流式细胞仪。下表列举了部分可用于CBA Flex Set检测的流式细胞仪；

仪器型号	报告参数	分群参数
BD FACSVerse flow cytometer	PE	CBA Red and CBA NIR
BD Accuri C6 flow cytometer	FL2	FL4 and FL3
BD FACSArrayTM bioanalyzer	Yellow	Red and NIR
BD FACSCanto II flow cytometer	PE	APC and APC-Cy7
BD LSRFortessa flow cytometer
BD FACSAria III cell sorter
BD FACSCalibur flow cytometer （双激光）	FL2	FL4 and FL3

2)  12×75 mm BD FalconTM流式上样管或同类产品； 
3)  15 ml聚丙烯圆锥底离心管或同类产品； 
4)  CBA Flex Set 分析软件：FCAP Array软件 (PC机版本：641488 / Mac版本：645447)。 

1.  制备人可溶性蛋白自由组合试剂标准品

1)  将一瓶冻干的细胞因子标准品小球转移至15ml锥形离心管中，标记为最高浓度标准品（2500pg/ml）；
2)  用4ml Assay Diluent 稀释标准品，室温平衡至少15分钟；
3)  用枪头轻柔混匀标准品，不要涡旋或剧烈振荡混匀；
4)  取9支12x75mm流式管，分别标记梯度稀释倍数1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256；
5)  每管加入500μl Assay Diluent；
6)  从最高浓度标准品开始逐个加入500μl倍比稀释液，梯度稀释标准品，如下图所示：(从最高浓度标准品管取500μl溶液至1：2管，吹打混匀，随后从1：2管取500μl溶液至1：4管吹打混匀，依此类推，直至1:256管)；

 

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7)  最后取1支12x75mm流式上样管中加入500μl Assay Diluent作为阴性指控管（0pg/ml）。

2.  混合人可溶性蛋白自由组合试剂捕获微球

1)  样本为上清液时：

a)  确定BD CBA 人可溶性蛋白自由组合试剂的数量（即自由组合的细胞因子的种类）； 
b)  确定试验样本数。注：为避免实验操作中多次加样导致的液体丢失导致试剂不足，混合捕获微球时建议多混合2-3个样本的量；
c)  混合前每种捕获微球需Vortex充分振荡混匀至少15秒；  
d)  按照50μl/样本确定试验中所需稀释的捕获微球总量。如样本数为35，则稀释的捕获微球的体积为35x50μl=1，750μl； 
e)  按照1μl/样本确定每种捕获微球的体积。如样本数为35，则捕获微球的体积为35μl； 
f)   确定捕获微球稀释液的体积：捕获微球稀释液的体积=稀释的捕获微球总量-捕获微球体积。如检测1种因子：捕获微球稀释液体积为 1，750μl-（35μl x 1）=1，715μl；如检测5种因子，捕获微球稀释液体积为 1，750-（35μl x 5）=1，575μl； 
g)  将捕获微球与捕获微球稀释液混匀于一管中，标记"混合捕获微球"。  

2)  样本为血清或血浆时：

a)  确定BD CBA 人可溶性蛋白自由组合试剂的数量（即自由组合的细胞因子的种类）； 
b)  确定试验样本数。注：为避免实验操作中多次加样导致的液体丢失导致试剂不足，混合捕获微球时建议多混合2-3个样本的量； 
c)  混合前每种捕获微球需Vortex充分振荡混匀至少15秒； 
d)  按照1μl/样本确定每种捕获微球的体积，将微球加入试管中，标记"混合捕获微球"； 
e)  在混合微球管中加入0.5ml 洗液，200g 离心5分钟； 
f)  小心去除上清液，避免将微球倒出试管； 
g)  按照50μl/样本确定好的体积用血清/血浆捕获微球稀释液重悬微球;如样本数为35,则血清/血浆捕获微球稀释液的量为35x50μl=1，750μl； 
h)  重悬捕获微球，使用前室温孵育15分钟。

3. 制备人可溶性蛋白自由组合试剂PE标记的检测抗体 

a)  确定BD CBA 人可溶性蛋白自由组合试剂的数量（即自由组合的细胞因子的种类）； 
b)  确定试验样本数。注：为避免实验操作中多次加样导致的液体丢失导致试剂不足，混合捕获微球时建议多混合2-3个样本的量； 
c)  按照50μl/样本确定试验中所需稀释的PE标记检测抗体的总量。如样本数为35，则检测抗体的体积为35x50μl=1，750μl； 
d)  按照1μl/样本确定PE标记检测抗体试剂的量。如如样本数为35，则PE标记检测抗体试剂的体积为35μl； 
e)  确定PE标记检测抗体稀释液的体积：检测抗体稀释液的体积=稀释的检测抗体总量-检测抗体试剂体积。如检测1种因子：PE检测抗体稀释液体积为 1，750μl-（35μl x 1）=1，715μl；如检测5种因子，PE检测抗体稀释液体积为 1，750-（35μl x 5）=1，575μl； 
f)  用检测抗体稀释液稀释PE检测抗体试剂，混匀于一管中，标记"混合PE检测抗体"。使用前4°C避光保存。 

4.  人可溶性蛋白自由组合试剂与样本孵育

1)  标准品与待测样本； 
a)  标准品管中每管加入50μl梯度稀释好的标准品，标准品浓度如下表所示；

管号	浓度（pg/ml)	稀释倍数
1	0	未稀释(Assay Diluent)
2	10	1:256
3	20	1:128
4	40	1:64
5	80	1:32
6	156	1:16
7	312	1:08
8	625	1:04
9	1250	1:02
10	2500	最高浓度标准品

b)  样本管中每管加入50μl待测样本； 
2)  涡旋混合微球至少5秒钟，每管加入50μl混合微球。轻柔混匀； 
3)  室温孵育1小时； 
4)  每管加入50μl PE标记的检测抗体，轻柔混匀； 
5)  室温孵育2小时；（期间可进行流式细胞仪的仪器调试）。

5.  上机检测

1)  每管加入1ml洗液清洗样本，200g 离心5分钟；
2)  小心吸去或轻柔倒掉上清液，每管加入300μl洗液重悬细胞； 
3)  仪器调校完毕后尽快上机检测(为避免标准品及待测样本中细胞因子降解，建议尽快上机检测，如有拖延将样本置于冰上，但不可过夜)。 

6.  数据分析

样本收集完毕（FCS2.0格式）后，用CBA专用分析软件FCAP Array v3.0进行标准曲线绘制及数据分析。