1.1 序列查询、引物设计、酶切位点的分析

用NCBI进行序列的查询，找到CDS序列或者启动子序列等等(根据客户实验而定)，用Premier 5或Snapgene(SC-1-1)或CLC Main Workbench, Network Plus(832041)软件设计引物，转录本的注意可变性剪切的问题，Genbank有完整的核酸信息；

酶切位点注意PCR片段是否含有使用的酶切位点，载体酶切位点选取尽量不要选取相近的酶切位点，尽量不要选非单一位点，尽量不要选取靠边的位点，后续验证，尽量不要选择平末端的酶切位点；

包含保护碱基+酶切位点+CDS结合区域(可选)，引物长度在16-23bp，退火的温度55-65度，GC含量在40-60%，避免二级结构，会不利于结合到模板，避免发卡、自身互补等结构，避免重复序列处设计引物，会发生错配的情况，设计好的引物需要在NCBI进行blast，验证其特异性。