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在FFPE样本的前处理过程中,福尔马林固定使得组织中的DNA之间、DNA与蛋白质、RNA等发生随机交联并使得DNA降解,石蜡包埋过程又加速了DNA降解,给下游的PCR及高通量测序带来很大挑战。
该流程按照QIAGEN的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(货号:56404)流程为例,此试剂盒中不包含脱蜡成分,可单独购买QIAGEN Deparaffinization Solution(19093)或选择完整试剂盒(56604)。
实验步骤
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切除多余石蜡
用解剖刀将样本块多余的石蜡切除;
切片
切8片5–10μm厚的样本;(如果样本外围暴露于空气,可以丢弃开始的2—3片);
加入脱蜡液
把切好的样本立刻置于1.5或2ml离心管中,并加入1ml脱蜡液(货号:19093)。盖上管盖于振荡器上剧烈震荡10s;
离心
最大转速室温离心2分钟;去上清,切勿碰到沉淀;
加入乙醇
加入1ml 96–100%乙醇于沉淀,振荡混匀;(乙醇抽提样本中残余的二甲苯),最大转速室温离心2分钟;去上清,切勿碰到沉淀;(用小枪头小心去除残余乙醇);
孵育
打开管盖室温(15–25°C)或37°C孵育10分钟,直到残留的酒精蒸发干净;
加入试剂,混匀震荡
用180μl Buffer ATL重悬沉淀,加入20μl proteinase K,振荡混匀;
孵育
56°C孵育1小时,直到样本完全裂解;90°C孵育1小时;(在Buffer ATL中90°C孵育会部分逆转核酸的甲醛修饰,过长的孵育时间或过高的孵育温度都会导致更多的DNA断裂。如果只有一个水浴装置,在56°C孵育完后请置于室温,等到水浴升到90°C再开始孵育);
短暂离心
短暂离心,去除1.5ml离心管管盖内壁的液滴;
加入Buffer和乙醇
加200ul Buffer AL到样品中,振荡器上彻底混匀,然后加入2ml 96–100%乙醇,再次用振荡器彻底混匀;短暂离心,去除1.5ml离心管管盖内壁的液滴;
弃除装有流液的收集管
将QIAamp MinElute column放置在2ml收集管中,在不打湿边缘的情况下,将全部裂解液小心转移到QIAamp MinElute column,盖上管盖,6000xg(8000rpm)离心1分钟,将QIAamp MinElute column放置于另一个干净的2ml收集管中,弃除装有流液的收集管;
加入Buffer AW1,并离心
小心打开QIAamp MinElute column,在不打湿边缘的情况下,加入500ul Buffer AW1,盖上管盖,6000xg(8000rpm)离心1分钟,将QIAamp MinElute column放置于另一个干净的2ml离心管中,弃除装有流液的收集管;
加入Buffer AW2,并离心
小心打开QIAamp MinElute column,在不打湿边缘的情况下,加入500ul Buffer AW2。盖上管盖,6000xg(8000rpm)离心1分钟,将QIAamp MinElute column放置于另一个干净的2ml离心管中,弃除装有流液的收集管;
离心
全速20,000xg(14,000rpm)离心3分钟以彻底干燥QIAamp MinElute column中的膜;
加入Buffer ATE
将QIAamp MinElute column置于一个干净的1.5ml离心管内,弃除装有流液的收集管。小心打开QIAamp MinElute column的管盖,往膜中央加入20–100μl Buffer ATE;
得到纯化后的DNA
盖上管盖,室温(15–25°C)放置1分钟,全速20,000xg(14,000rpm)离心1分钟。得到纯化后的DNA。