视频素材来源于YouTube https://www.youtube.com/watch?v=1pQ7-KDuE_Y
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本流程以QIAGEN的QIAamp RNA Blood Mini Kit(货号:52304)流程为例:
实验步骤
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混合
将1倍体积的人类全血与5倍体积的Buffer EL在相应体积的管子(试剂盒不提供)中混合;
孵育并混匀
在冰上孵育10—15分钟,在孵育的过程中可以通过涡旋的方法简单的混匀2次;
离心,弃上清
400xg,4°C离心10分钟,全部去除并丢弃上清液;
重悬细胞
将Buffer EL加到细胞沉淀中去(Buffer EL的体积为步骤1中使用的全血的2倍体积的),用涡旋的方法简单的重悬细胞;
离心,弃上清
400xg,4°C离心10分钟,全部去除并丢弃上清;
加入Buffer RLT,重悬沉淀
将相应体积的Buffer RLT加到白细胞沉淀中。涡旋或者用移液枪重悬沉淀。(以2*106个白细胞,加入350uL比例加入);
裂解液均质化
将裂解液用移液枪加入已经放置在2ml收集管(试剂盒提供)的QIAshredder spin column中,用最大的速度离心2分钟,使裂解液均质化。丢弃QIAshredder spin column,保存均质化的裂解液;
加入乙醇
在均质化的裂解液中加入1倍体积的70%乙醇(350μl或600μl),用移液枪充分混匀,不要离心;
转移样品
用移液枪小心地将样品(包括任何可能形成的沉淀物),转移到新的已经放置在2ml收集管(试剂盒提供)上的QIAamp spin column中,不要弄湿边缘。8000xg(10,000rpm)离心15s。柱子最大的上样体积为700μl。如果样本量超过700μl,将样本分为几份,依次地加入柱子中并离心;
加入Buffer RW1,清洗RNA
将QIAamp spin column转移到新的2ml收集管中(试剂盒提供),加入700μl Buffer RW1 。≥8000xg(≥10,000rpm)离心15s,清洗RNA;
加入Buffer RPE,离心
将QIAamp spin column转移到新的2ml收集管中(试剂盒提供),用移液枪加入500μl Buffer RPE,≥8000xg(≥10,000rpm)离心15s;
加入Buffer RPE,离心
小心地打开QIAamp spin column,并加入500μl Buffer RPE。盖上盖子,在最高转速20,000xg(14,000rpm)离心3min;
得到纯化后的DNA
将QIAamp spin column转移到1.5ml离心管(试剂盒提供)上,用移液枪将30–50μl RNase-free water(试剂盒提供)加到柱子的膜上。≥8000xg(≥10,000rpm)离心1min,洗脱RNA。如果样本量>0.5ml全血(或2x106白细胞),重复该步骤。收集纯化后的DNA。