6.1.2 DNA靶向建库

开始前的要点
·  该方案涵盖了从“标准 DNA ”（即细胞或组织）、 FFPE DNA 和 cfDNA 制备 Illumina 测序仪文库所需的所有程序。

·  在建立反应之前，准确测定输入 DNA 的量至关重要（标准 DNA 或 cfDNA 为 10-80 ng ；如果使用了 QIAseq QuantiMIZE 试剂盒，则最多可以使用 250 ng FFPE DNA 。如果使用替代方法测定 FFPE DNA 的浓度，则最多可以使用 100 ng DNA ）。可以降低输入量；然而，这将导致更少的测序UMI和降低变体检测灵敏度。

·  在冰上设置反应。

·  不要涡旋任何试剂或反应。

程序： 碎片、末端修复和 A- 添加

1.  在冰上解冻核酸样品。轻轻混合，短暂离心以收集管侧的残余液体，然后放回冰中。

2.  制备碎片、末端修复和 A- 添加所需的试剂。
    2a：解冻碎片缓冲液， 10倍 ； FERA 溶液；和 FG 溶液（如果需要）在室温下，但在解冻后放在冰上。
    2b：轻弹试管进行混合，然后短暂离心。
    注意： 碎裂酶混合物应在使用前从冰箱中取出，并放置在冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

3.  在冰上，根据 表6 制备碎裂、末端修复和 A 加成混合物。短暂离心，上下吹打 7-8 次 混合，然后再次短暂离心。

    注意： 一般而言，增加 DNA 输入量将提高变异检测灵敏度——尤其是对于 FFPE DNA 。有关详细信息，请参见 ( QIAGEN 官网货号为 333502 的产品完整说明书进行了解)

Component	Volume/reaction (standard, FFPE or pure cfDNA)	Volume/reaction (cfDNA contaminated with cellular DNA)
DNA*	Variable	Variable
Fragmentation Buffer, lOx	2.5 μl	2.5 μl
FERA Solution	0.75 μl	0.75 μl
FG Solution	-	1.25 μl
Nuclease-free Water	Variable	Variable
Total	20 μl	20 μl

表6：碎片、末端修复和A-添加的反应混合物

*标准 DNA 或 cfDNA 为 10-80 ng 。如果使用 QIAseq QuantiMIZE 试剂盒，则使用高达 250 ng 的 FFPE DNA ；如果使用替代方法，则使用高达 100 ng 的 FFPE DNA

4.  向每个反应中添加 5µl 裂解酶混合物。短暂离心，通过上下移液管混合 7-8次 （不要涡流），然后再次短暂离心。

    重要事项： 在整个反应过程中，将反应管/板置于冰上。

5.  根据 表7对热循环器进行编程。使用仪器的加热盖。

Step	Incubation temperature	Incubation time (standard DNA)	Incubation time (FFPE DNA)	Incubation time (dDNA)
1	4℃	1 min	1 min	1 min
2	32℃*	24 min	14 min	14 min
3	72℃	30 min	30 min	30 min
4	4℃	Hold	Hold	Hold

表7.碎裂、末端修复和A-加成的循环条件*

*对于 Human Mitochondria Panel ，标准 DNA 和 FFPE DNA 均在 32°C 孵育 8 分钟

6.  在将管/板添加到热循环器之前，启动程序。当热循环器达到 4°C 时，暂停程序。

    重要事项： 热循环器必须预冷，并在 4°C 时暂停。

7.  将 步骤 2 中准备的管/板转移到预冷的热循环仪并恢复循环程序。

8.  完成后，让热循环仪恢复到 4°C 。

9.  将样品放在冰上，立即执行“方案：适配器连接”。

开始前的要点

·  碎片、末端修复和 A- 添加”中的 25µl 产品是本方案的起始材料。

·  在冰上设置反应。

·  不要涡旋任何试剂或反应。

·  重要提示：QIAseq 96 Unique Dual Index Set 转接板（ UDIN-96#A ）：转接连接反应中使用的 A 或 B 必须与匹配的 QIAseq 96 Unique Dual Index Set （ UDIS-96#K ）引物板配对：通用 PCR 扩增反应中使用的 A 或 B 。

程序： 适配器连接
1.  准备 DNA 连接所需的试剂。
    1a：在室温下解冻连接缓冲液 5x 和连接溶液，但解冻后放在冰上。
    1b：通过轻弹试管混合，然后短暂离心。
    注意：DNA 连接酶 应在使用前从冰箱中取出并放在冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

2.   根据 表8 制备适配器连接混合物。短暂离心，上下移液混合 10-12次 ，再次短暂离心。

    重要提示： 每个连接反应只能使用一个单索引衔接子。 图4 中描述了 QIASEQ 96-UNIQUE 双索引集适配器布局；在使用多通道移液管吸取适当数量的适配器之前，使用多通道移液管刺穿箔片。如果使用 QIASEQ 12Index I 适配器，则一次打开一根适配器管，避免交叉污染。对于平板中提供的 QIASEQ 96-Index I 适配器（布局如 图7 所示）。
    重要提示： 缓慢吸取以混合。反应混合物非常粘稠。不要涡旋。

    注意： 如果设置一个以上的反应，则制备比反应总数所需的体积大 20% 的主混合物。

 

Component	Volume/reaction
	Standard DNA	FFPE DNA	cfDNA
Frogmentation, end-repair, and A-addition reaction (already in tube)	25 μl	25 μl	25 μl
Ligation Buffer, 5x	10 μl	10 μl	10 μl
UDIN-96#A or IL-N7## or IL-7##NJ or UDIN-8#A adapter*	2.8 μl	2.8 μl	0.5 μl
DNA Ligase	5 μl	5 μl	5 μl
Ligation Solution'	7.2 μl	7.2 μl	7.2 μl
Nuclease-free Water	-	-	2.3 μl
Total	50 μl	50 μl	50 μl

表 8. 适配器连接的反应混合物

↑： 适用于 QIAseq 96-Unique Dual Index Set A 或 B 或 IL-N7## 组件的 UDIN-96#A 适用于 QIAseq 12-Index I 最多 12 个 样本索引的适配器；或带有 QIAseq 96-Index I A、B、C 或 D 组 ( CDI ) 的 IL-7##NJ 适配器；或 UDIN-8#A 用于 QIAseq 8-Unique Dual Index Set A 或 B 。

注： 连接溶液非常粘稠。它应该单独添加到每个反应中，而不是与其他组分预混合作为主混合物。不要用连接溶液涂在移液器吸头的外部，否则可能会添加过多的体积。

图 4. 可刺穿的 QIAseq 96-Unique Dual Index Set Adapter Plate 布局。 QIAseq 96-Unique Dual Index Set A (96) 布局 (NQDIB001-NQDIB096) 和 QIAseq 96-Unique Dual Index Set B (96) 布局 (NQDIB097NQDIB192)。

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QIAseq 96索引I集合A或C集合中的IL-701NJ转接板

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QIASEQ 96-索引I套件B或D套件中的IL-716NJ转接板

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图 5. QIAseq 96-Index I Set A、B、C 或 D 中样品接头的布局。每个板的 A 到 D 行都有接头。  E 到 H 行是空的。 每行每个孔包含一个样品接头，每个孔中的接头数量足以容纳 8 个样品。

3.  根据 表9 在热循环器中孵化反应。

    重要提示： 不要使用加热盖。

 

Step	Incubation temperature	Incubation time
1	4℃	1 min
2	20℃	15 min
3	4℃	Hold

表 9. DNA 连接的孵育条件

4.  运行完成后，对于标准 /FFPE 样品，添加 50 µl 无核酸酶水使每个样品达到 100 µl 。 对于 cfDNA 样本，添加 30 µl 无核酸酶水，使每个样本达到 80 µl 。

5.  对于标准 /FFPE 样品，添加 100µL Qiaseq 微珠。对于 cfDNA 样品，添加 112µL Qiaseq 珠子。用移液管上下移动几次，充分混合。

 

6.  在室温下孵育 5分钟 。

7.  将管/板放在磁架上 10 分钟 。溶液清除后，磁珠仍在磁架上，小心取出并丢弃上清液。

    重要提示： 不要丢弃珠子，因为它们含有感兴趣的 DNA 。

 

8.   将珠子仍放在磁性支架上，添加 200µl 80% 乙醇。小心地取出并丢弃清洗液。

9.  重复乙醇清洗。

    重要提示： 第二次清洗后完全清除所有微量乙醇。首先用 200µl 移液管除去乙醇，然后用 10µl 移液管除去任何残留的乙醇。

10. 磁珠仍在磁力架上，在室温下风干 10 分钟 。

    注意： 目视检查颗粒是否完全干燥。

11. 从磁性支架上取下珠子，并通过添加 52µl 无核酸酶水从珠子中洗脱 DNA 。通过移液管充分混合。

12. 将试管/板放回磁性支架，直到溶液清除为止。

13. 将 50µL 上清液转移到干净的试管/板中。

14.  对于标准 /FFPE 样品，添加 50 µl QIAseq Beads （对于 Human Mitochondria Panel ，使用 35 µl ）。对于 cfDNA 样本，添加 70 µl QIAseq Beads 。通过上下吹打数次充分混合。

15. 在室温下孵育 5分钟 。

16. 将试管/板放置在磁架上 5分钟 （试管）或 10分钟 （板）。溶液澄清后，磁珠仍在磁性支架上，小心取出并丢弃上清液。

    重要提示： 不要丢弃珠子，因为它们含有感兴趣的 DNA 。

17. 将珠子仍放在磁性支架上，添加 200µl 80% 乙醇。小心地取出并丢弃清洗液。

18. 重复乙醇清洗。     重要提示： 第二次清洗后完全清除所有微量乙醇。首先用 200µl 移液管除去乙醇，然后用 10µl 吸液管除去任何残留的乙 醇。

19. 将小球仍放在磁性支架上，在室温下风干 15分钟 。     注意： 目视检查小球是否完全干燥。乙醇携带到目标富集 PCR 步骤将影响富集 PCR 效率。从磁性支架上取下珠子，并通过添加 12µl 无核酸酶水从珠子中洗脱 DNA 。通过移液管充分混合。

20. 将试管/板放回磁架，直到溶液清除。

21. 将 9.4µl 上清液转移到干净的管或板中。

22.  继续执行“方案：目标浓缩”。或者，样品可在 −30至−15°C 的恒温冰箱中储存最多 3天 。

1.  准备目标富集所需的试剂。 
    1a： 解冻 TEPCR 缓冲液， 5x ； QIAseq 靶向 DNA 面板；和 IL-Forward Primer 在室温下，解冻后放在冰上。 
    1b： 轻弹试管混合，然后短暂离心。

    注意： HotStarTaq DNA 聚合酶应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。根据 表 10 制备目标富集混合物。短暂离心，上下吹打 7-8 次 混合，然后再次短暂离心。

Component	Volume/readion
Sample (from wProtocol: Adapter Ligation")	9.4μl
TEPCR buffer, 5x	5μl
QIAseq Targeted DNA Panel	5μl
IL-Forward primer	0.8μl
HotStarTaq DNA Polymerase	0.8μl
Total	20μl

表10.目标浓缩的反应混合物

2.  使用 表11 （底漆/管 <1500 的面板）或 表12 （底漆/管 <1500 的面板）中的循环条件编程热循环器 ≥1500 个底漆/管）。

Step	Time	Temperature
Initial denaturation	13 min	95℃
	2 min	98℃
8 cycles	15 s	98℃
	10 min	68℃
1 cycle	5 min	72℃
Hold	∞	4℃

表11.如果引物数量<1500/管，则目标富集的循环条件

Step	Time (1500-12,000 primers/tube)	Time (>12,000 primers/tube)	Temperature
Initial denaturation	13 min 2 min	13 min 2 min	95℃ 98℃
6 cycles	15s 15 min	15s 30 min	98℃ 65℃
1 cycle	5 min	5 min	72℃
Hold	8	8	4℃

表12.如果引物数量增加，目标富集的循环条件≥1500/管

3.  将目标富集反应置于热循环仪中，并开始运行。

4.  运行完成后，对于标准 /FFPE 样品，添加 80µl 无核酸酶水，使每个样品达到 100µl 。对于 cfDNA 样品，添加 7 0µl 无核酸酶水，使每个样品达到 90µl 。

5.  对于标准 /FFPE 样品，添加 100µl QIAseq 珠子（对于人线粒体面板，使用 70µl ）。对于 cfDNA 样本，添加 108µl QIAseq 珠子。用移液管上下数次搅拌均匀。

6.  在室温下孵育 5分钟 。

7.  将管/板放在磁架上 5 分钟 （用于管）或 10 分钟 （用于板）。溶液澄清后，磁珠仍在磁架上，小心取出并丢弃上清液。

    重要提示： 不要丢弃珠子，因为它们含有感兴趣的 DNA 。

8.  将珠子仍放在磁性支架上，添加 200µl 80% 乙醇。小心地取出并丢弃清洗液。

9.  重复乙醇清洗。

    重要提示： 第二次清洗后完全清除所有微量乙醇。首先用 200µl 移液管除去乙醇，然后用 10µl 吸液管除去任何残留的乙醇。

10.  将小球仍放在磁性支架上，在室温下风干 10分钟 。

    注意： 目视检查小球是否完全干燥。乙醇带入下一个通用 PCR 步骤将影响 PCR 效率。

11.  从磁性支架上取下珠子，并通过添加 16µl 无核酸酶水从珠子中洗脱 DNA 。通过移液管充分混合

12.  将管/板放回磁性支架，直到溶液清除为止。

13.  将 13.4µL 上清液转移至干净的试管/板中。

14.  继续执行第 41页 的“方案：通用 PCR ”。或者，样品可在 −30至−15°C 的恒温冰箱中储存最多 3天 。

开始前的要点

·  在 Illumina 平台上进行测序时，必须使用 QIAseq A Read1 Primer I （ Custom Read 1 Sequencing Primer ）。

·  Illumina 平台上的 QIAseq Targeted DNA Panel 应使用双末端测序。

·  为了使测序准备更加方便，请从 www.qiagen.com 的 QIAseq Targeted DNA Panel 的 Product Resources 选项卡中下载适用于不同测序仪器的 Illumina 兼容样品表。

使用 QIAseq 96-Unique Dual Index Sets 对 MiSeq 进行测序准备

1. 使用 QIAseq Targeted DNA Panel 定制 QIAseq 96-Unique Dual Index Sets 时，使用仪器上的 Local Run Manager (LRM) v2 上传样品表并继续测序： Read 1 为 149 bp ， Read 2 为 149 bp ，每个 Index Read 为 10 bp 。

2.  样品稀释和汇集：将文库稀释至 2 或 4 nM ，用于 MiSeq 。 然后，如果每个库需要相似的测序深度，则以等摩尔量将具有不同样本索引的库组合起来。  
  注意： 文库稀释浓度建议基于 QIAseq Library Quant System 。 
    如果将具有相同数量引物的库组合在一起，则将等量的单个库以 4 nM 汇集在一起。如果文库有不同的引物编号，则根据它们的引物数量以体积比组合文库。 例如，文库 A 有 5000 个 4 nM 的引物，文库 B 有 600 个 4 nM 的引物； 将 50 µl 文库 A 与 6 µl 文库 B 结合起来，在同一次测序运行中，文库 A 和 B 的覆盖深度相似。

3.  文库准备和加载：根据 MiSeq 系统变性和稀释文库指南准备文库并将其加载到 MiSeq 。   MiSeq 上的最终文库浓度为 10–12 pM 。

    注意： 关于文库加载浓度的建议基于 QIAseq Library Quant System 。

4.  用于 Read 1 制备和加载的定制测序引物：使用 597 µl HT1 （杂交缓冲液）稀释 3 µl QIAseq A Read 1 Custom Primer I ，以获得 0.5 µM 的最终浓度。 将 600 µl 稀释的 QIAseq A Read 1 Primer I 加载到 MiSeq 试剂盒的位置 18 （ 图 1 ）。 

图1. MiSeq试剂盒。A: 读取1自定义底漆的位置18，B和C：不相关。

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5.  完成测序运行后，继续执行附录。（附录可从 QIAGEN 官网上下载货号为 333502 的全部说明书）

使用 QIAseq 12-Index I、QIAseq 96 Index I Sets 和 QIAseq 8-Unique Index Sets 对 MiSeq 进行测序准备

1.  使用 QIAseq Targeted DNA Panel 定制 QIAseq 12-Index I、QIAseq 96-Index I Sets 和 QIAseq 8-Unique Index Sets 时，使用仪器上的 LRM v2 上传样品表（参见 QIAseq 的产品资源选项卡 Targeted DNA Panel 并下载适当的模板）并继续测序： Read 1 为 151 bp ， Read 2 为 151 bp ，每个 Index Read 为 8 bp 。 或 使用 Illumina Experiment Manager v1.2 或更高版本设置带有 Custom Sequencing Read 1 引物的样品表（ 图 11 ）。   QIAseq Targeted DNA Panel 的样本索引与 Illumina Nextera XT v2 适配器样本索引系统兼容。 设置参数详情可在 QIAGEN 官网下载货号为 333502 的产品完整说明书。

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图11.使用Illumina实验管理器的样本表。

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2.  按照“使用 QIASEQ 96- 唯一双索引集对 MISEQ 进行测序准备”中的步骤 2–5 进行操作。

使用QIAseq 96唯一索引集对NextSeq 500/550进行测序准备

1.  使用 QIAseq Targeted DNA Panel 定制 QIAseq 96-Unique Dual Index Sets 时，使用仪器上的 LRM v2 上传样品表（参见 QIAseq Targeted DNA Panel 的产品资源选项卡并下载适当的模板）并继续测序 ： Read 1 为 149 bp ， Read 2 为 149 bp ，每个 Index Read 为 10 bp 。

2.  样品稀释和汇集：将文库稀释至 0.5、1、2 或 4 nM ，用于 NextSeq 。 然后，如果每个库需要相似的测序深度，则以等摩尔量将具有不同样本索引的库组合起来。

3.   文库准备和加载：根据 NextSeq 系统变性和稀释文库指南准备文库并将其加载到 NextSeq 500/550。  NextSeq 500/550 上的最终文库浓度为 1.0–1.2 pM 。

4.  用于 Read 1 制备和加载的定制测序引物：使用 1994 µl HT1 （杂交缓冲液）稀释 6 µl QIAseq A Read 1 Primer I （已提供）以获得 0.3 µM 的最终浓度。 将 2 ml 稀释的 QIAseq A Read 1 Primer I 加载到 NextSeq 试剂盒的位置 7 （ 图 12 ）。

图12.NextSeq试剂盒

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5.  完成测序运行后，继续执行“附录 D ”。（附录内容可从凯杰官网下载货号为： 333502 的完整产品说明书）。

NextSeq 500/550 与 QIAseq 12-Index I、QIAseq 96-Index I Sets 和 QIAseq 8-Unique Index Sets 的测序准备工作

1.  当使用 QIASEQ Targeted DNA Panel Custom QIASEQ 12-Index I、QIAS-EQ 96-Index I Sets 和 QIAS-EQ 8-Unique Index Sets 时，请使用仪器上的 LRM V2 上传样本表（请参阅 QISASEQ Targeted DNA Panel 的“产品资源”选项卡并下载相应的模板）并继续测序：读取 1 为 151 BP ，读取 2 为 151 BP ，读取的每个索引均为 8 BP 。

2.  按照“使用 QIAseq 96Unique Index Sets 对 NextSeq 500/550 进行测序准备”中的步骤 2-5 。

使用 QIAseq 96-Unique Index Sets 进行 MiniSeq 的测序准备
1.  使用 QIASEQ Targeted DNA Panel Custom QIASEQ 96-Unique Dual Index Sets 时，请使用仪器上的 LRM V2 上传样本表（请参阅 QISAEQ Targeted DNA Panel 的“产品资源”选项卡并下载相应的模板）并继续进行测序：读取 1 为 149 BP ，读取 2 为 149 BP ，读取的每个索引均为 10 BP 。

2.  样品稀释和合并：对于 MiniSeq ，将文库稀释至 0.5、1、2 或 4nM 。然后，如果每个文库需要相似的测序深度，则以等摩尔量组合具有不同样品索引的文库。
    注： 文库稀释浓度的建议基于 QIASEQ 文库定量系统。

3.  文库制备和加载：根据 MiniSeq 系统变性和稀释文库指南，制备文库并将其加载到 MiniSeq 上。 MiniSeq 上的最终文库浓度为 1.0–1.2pM 。
    注： 库加载浓度的建议基于 QIASeq Library Quant 系统。

4.  用于 Read 1 制备和加载的定制测序引物：使用 997 µl HT1 （杂交缓冲液）稀释 3 µl QIAseq A Read 1 Primer I （已提供）以获得 0.3 µM 的最终浓度。 将 1 ml 稀释的 QIAseq A Read 1 Primer I 加载到 MiniSeq 试剂盒的位置 15 （ 图 12 ）。

图 13. MiniSeq 试剂盒。

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5.  完成测序运行后，继续执行附录（附录可从 QIAGEN 官网上下载货号为 333502 的全部说明书）”。

使用QIAseq 12-索引I，QIAseq 96-索引I集和QIAseq 8-唯一索引集进行MiniSeq的测序准备

1.  当使用 QIAseq 目标 DNA 面板自定义 QIAseq 1 2 -索引 I ， QIAseq 96- 索引 I 集和 QIAseq 8- 唯一索引集时，使用仪器上的 LRM v2 上传样品表 (请参阅 QIAseq 靶向 DNA 面板的产品资源选项卡并下载相应的模板) 并进行测序: 读取 1 为 151 bp ，读取 2 为 151 bp ，每个索引读取为 8 bp 。

2.   按照“使用 QIASEQ 96 唯一索引集对 NextSeq 500/550 进行测序准备”中的步骤 2–5 进行操作。

使用QIASEQ 96-唯一索引集对NovaSeq制剂进行测序

1.   使用 QIAseq Targeted DNA Panel 定制 QIAseq 96-Unique Dual Index Sets 时，上传样品表（参见 QIAseq Targeted DNA Panel 的产品资源选项卡并下载适当的模板）并继续测序：读取 1 为 149 bp ，  Read 2 为 149 bp ，每个 Index Read 为 10 bp 。

2.  样品稀释和汇集：将 NovaSeq 的文库稀释至 10 nM 。然后，如果每个库需要相似的测序深度，则以等摩尔量将具有不同样本索引的库组合起来。

3.  文库制备和加载：根据 NovaSeq 6000 测序系统指南（ Part#1000000019358 ）制备文库并将其加载到 NovaSeq 上。最终合并的文库浓度建议在 1.0 和 1.5pM 之间，在 NovaSeq 上产生 200 和 300pM 之间的最终加载浓度。
    注： 文库加载浓度的建议基于 QIASeq Library Quant 系统。

4.  用于 Read 1 的定制测序引物制备和加载: S4 模式: 使用 3489.5 µl HT 1 (杂交缓冲液) 稀释 10.5 µl QIAseq A Read 1 引物 I (提供) 以获得 0.3 µm 的终浓度。将稀释的 QIAseq A 读取 1 引物 I 的 3.5毫升 加载到 NovaSeq 试剂盒的位置 5 ( 图14 )。
    SP/S1/S2 模式：使用 1994µL HT1 （杂交缓冲液）稀释 6µL Qiaseq A Read 1 引物 I （提供），以获得 0.3µM 的最终浓度。将 2 mL 稀释的 QIASeq A Read 1 Primer I 加载到 NovaSeq 试剂盒的位置 5 （ 图14 ）。

图 14. NovaSeq 试剂盒。

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