6.1.5 cfDNA建库

开始前的要点

· 标有 � 表示 4 ml 样品体积的血浆；标有 e 表示 5 ml 样品体积的血浆。

· 所有离心步骤均在室温 (15–25°C) 下进行。

· 关闭步骤之间的真空，以确保在操作步骤步骤期间应用一致、均匀的真空。

开始前要做的事情

· 将样品平衡至室温。

· 如果样品� ≤ 4 ml 或 e < 5 ml ，用磷酸盐缓冲盐水将体积增加到�  4 ml 或 e 5 ml 。

· 按照第 17 页 所述设置 QIAvac 24 Plus 。（ 17 页的内容，可从 QIAGEN 官网下载货号为 180015 的全部内容进行了解）

· 将水浴或加热块加热至 60°C ，以便在 步骤 4 中与 50 ml 离心管一起使用。

· 将加热块加热 至 56°C ，以便在 步骤 14 中与 2 ml 收集管一起使用。

· 将缓冲液 AVE 平衡至室温，以便在 步骤 15 中进行洗脱。

· 确保缓冲区 ACB 、缓冲区 ACW1 和缓冲区 ACW2 已根据第 17 页 上的说明准备好。

程序
1.  吸取 � 400 µl 或e 500 µl QIAGEN 蛋白酶 K 到 50 ml 离心管（未提供）中。

2.  向试管中加入� 4 ml 或 e 5 ml 血浆。

3.  添加� 3.2 ml 或 e 4.0 ml Buffer ACL 。关闭盖子并通过脉冲涡旋混合 30 秒 。确保管中形成可见的涡流。为确保有效裂解，样品和缓冲液 ACL 必须彻底混合以产生均质溶液。
    注意： 此时不要中断程序。立即进行 第 4 步 以开始裂解孵育。

4.   在 60°C 下孵育 30 分钟 。

5.  将试管放回实验室工作台上并拧下盖子。

6.  将� 7.2 ml 或 e 9 ml Buffer ACB 添加到试管中的裂解液中。关闭盖子并通过脉冲涡旋 15-30 秒 彻底混合。

7.  将试管中的裂解液-缓冲液 ACB 混合物在冰上孵育 5 分钟 。

8.  将 QIAamp Mini 色谱柱 插入 QIAvac 24 Plus 上的 VacConnector 。将 20 ml 试管延长器插入打开的 QIAamp Mini 柱 中。确保将试管延长器牢固地插入 QIAamp Mini 色谱柱 ，以避免样品泄漏。
    注意： 保留收集管以便在 步骤 13 中进行干转。

9.  小心地将 步骤 7 中的裂解液-缓冲液 ACB 混合物加入 QIAamp Mini 色谱柱 的管延长器中。打开真空泵。当所有裂解物完全通过柱子时，关闭真空泵并将压力释放到 0 mbar 。小心地取出并丢弃管延长器。请注意，大样品裂解液体积（从 5ml 样本开始时约为 20 毫升 ）可能需要长达 15 分钟 才能通过真空力通过 QIAamp Mini 膜 。为了快速方便地释放真空压力，应使用真空调节器（ QIAvac 连接系统的一部分）。
    注意： 为避免交叉污染，小心不要将试管延长器移到相邻的 QIAamp Mini 色谱柱 上。

10.  将 600 µl Buffer ACW1 加入 QIAamp Mini 色谱柱 。将柱子的盖子打开，然后打开真空泵。在通过 QIAamp Mini 柱 抽出所有 Buffer ACW1 后，关闭真空泵并将压力释放到 0 mbar 。

11.  将 750 µl Buffer ACW2 加入 QIAamp Mini 色谱柱 。将柱子的盖子打开，然后打开真空泵。在通过 QIAamp Mini 柱 抽出所有 Buffer ACW2 后，关闭真空泵并将压力释放到 0 mbar 。

12.  将 750 µl 乙醇 (96–100%) 加入 QIAamp Mini 色谱柱 。打开柱子的盖子，打开真空泵。在所有乙醇通过离心柱后，关闭真空泵并将压力释放到 0 毫巴 。

13.  关闭 QIAamp Mini 色谱柱 的盖子。将其从真空歧管中取出并丢弃 VacConnector 。将 QIAamp Mini 柱 放入干净的 2 ml 收集管中，全速 （20,000 x g；14,000 rpm） 离心 3 分钟 。

14.  将 QIAamp Mini Column 放入新的 2 ml 收集管中。打开盖子，将组件在 56°C 下孵育 10 分钟 以完全干燥膜。

15.  将 QIAamp Mini 柱 放入干净的 1.5 ml 洗脱管（已提供）中，并丢弃 步骤 14 中的 2 ml 收集管。小心地将 40–60 µl Buffer AVE 涂抹在 QIAamp Mini 膜 的中心。盖上盖子，在室温下孵育 3 分钟 。
    重要提示： 确保洗脱缓冲液 AVE 平衡至室温 (15–25°C) 。如果以小体积 （<50 µl） 进行洗脱，则必须将洗脱缓冲液分配到膜的中心以完全洗脱结合的 DNA 。洗脱体积灵活，可根据下游应用的要求进行调整。回收的洗脱液体积将比应用于 QIAamp Mini 色谱柱 的洗脱液体积少 5 µl 。

16.  在微量离心机中 （20,000 x g；14,000 rpm） 离心 1 分钟 以洗脱核酸。

开始前的要点

· QIAseq 测序接头溶解在双工缓冲液中，即可使用。 24-plex 一次性板的每个孔都包含通用和单个条形码适配器的等摩尔混合物。

· 适配器与所有 Ion Torrent 仪器完全兼容，包括 PGM™、Proton 和 S5 仪器。

· 只有该套件随附的适配器与创新的一体化末端修复和连接反应兼容。

· 大多数循环游离 DNA (cfDNA) 大小约为 170 bp，在文库制备之前不需要进一步碎片化。

· 在适配器连接步骤中不要使用加热的盖子。

开始前要做的事情

· 使用荧光法定量纯化的 双链 cfDNA 。从 1–100 ng cfDNA 缓冲液 EB 、无核酸酶 H2O 或 10 mM Tris•HCl (pH 8.0) 开始。在冰上解冻冷冻试剂。解冻后，应通过快速涡旋彻底混合缓冲液，以避免任何局部浓度。使用前短暂旋转涡旋试剂。

· 开始前，样本 cfDNA 应溶解在 Buffer AVE、EB/Tris 缓冲液或 H2O 中。

· 准备 80% 乙醇。

程序
1.  在设置一体化文库制备反应混合物之前，涡旋并向下旋转解冻的适配器板。

2.  根据表 2 在冰上设置多合一库制备反应混合物。取下保护适配器板盖。在移液前刺穿要使用的适配器板的每个孔的箔密封。

表 2. 一体化文库制备反应设置

零件	体积/反应
输入 DNA (cfDNA)	变量
多合一反应缓冲液，4x	22.5
多合一酶混合物	6
QIAseq Adapter Mix（24 重板）	5
无核酸酶水	多变的
总反应体积	90µl

3.  轻轻吹打 5-6 次 混合。

4.  加载到热循环仪上并启动一体化反应程序（ 表 3 ）。
    重要提示： 请勿使用带加热盖的热循环仪。

表 3. 末端补平、接头连接和缺口修复热循环条件

程序	温度	时间	附加评论
末端补平/连接	25ºC	30分钟	补平 DNA 片段末端和接头连接
修复	72ºC	5分钟	末端补平和连接酶的失活；缺口修复
	4°C	∞	抓住

5.  程序完成后，立即进行清理。

6.  将 90 µl 连接反应转移到 1.5 ml LoBind 管 或 PCR 板 中。

7.  向每个样品中加入 27 µl 重悬的 Agencourt AMPure XP 微珠 并混合。

8.  在室温下孵育 5 分钟 。

9.  将磁珠放在磁性支架上，等待溶液变清。

10.  将 110 µl 上清液转移到新的试管或 PCR 板 中。丢弃珠子。

11.  向每个样品中加入 27μl 重悬的 Agencourt AMPure XP 微珠 并混合。

12.  在室温下孵育 5 分钟 。

13.  将磁珠放在磁力架上，等待溶液变清，然后小心弃去上清液。

14.  向每个颗粒中加入 200 µl 新鲜的 80% 乙醇。将磁珠放在磁力架上，小心弃去上清液。

15.   重复 步骤 14 共 2 次乙醇洗涤。去除多余的乙醇。

16.  在磁力架上孵育 5-10 分钟 或直到珠子变干。过度干燥可能导致 DNA 回收率降低。从磁性支架上取下。

17.  通过重悬于 26 µl 缓冲液 EB 中进行洗脱。磁力架上的颗粒珠。小心地将 23.5 µl 上清液转移到新的 PCR 板 中。

开始前要做的事情

· 使用标题为“末端补平和适配器连接”的操作步骤制备库 cfDNA

· 在冰上解冻冷冻试剂。解冻后，应通过快速涡旋彻底混合缓冲液，以避免任何局部浓度。使用前短暂旋转涡旋试剂。

程序
1.  根据表 4 对带有加热盖的热循环仪进行编程。

表 4. 文库扩增循环条件

孵化时间	温度	循环次数
2 分钟	98°C	1
		可变，取决于 DNA 输入*：
20 s	98°C	7（100 ng 输入）；
30 s	60°C	10（10 纳克输入）；
30 s	72°C	12（1 ng 输入）
1分钟	72°C	1
∞	4°C	抓住

*PCR 循环数取决于输入 DNA 的数量和质量。

2.  根据表 5 在冰上准备反应。移液 6-8 次混合。

表 5. 扩增反应设置

零件	体积/反应（微升）
文库 DNA	23.5
HiFi PCR Master Mix,2x	25
Primer Mix	1.5
总反应体积	50µl

3.  将 PCR 板转移到热循环仪并启动程序。

4.  程序完成后，取出板，向每个扩增的文库中加入 50 µl 重悬的 Agencourt AMPure XP 微珠。

5.  按照步骤 12-16 进行操作。通过重悬于 27 µl 无核酸酶水或缓冲液 EB 中进行洗脱。将磁珠放在磁力架上。小心地将 25 µl 上清液转移到新试管中储存。

6.  使用毛细管电泳方法评估库质量。中位文库大小将是片段大小加上适配器的约 80 bp。可以使用 QIAseq Library Quant Array（单独出售）通过 qPCR 对文库进行量化。

7.  纯化的文库可以在 –20°C 下储存，直到准备好进行测序或混合捕获。

使用 QIAGEN 的 QIAxcel Advanced 或 Agilent Bioanalyzer 等毛细管电泳设备评估文库质量。检查预期的大小分布和 80 bp 附近是否缺少适配器或适配器二聚体，以及大量不需要的较大库片段（参见图 6）。
注意：中间库大小将是片段大小加上适配器的 80 bp。可以使用 QIAseq Library Quant Array（单独出售）通过 qPCR 对文库进行量化。
注意：中间片段大小可用于后续基于 qPCR 的量化方法，以量化库浓度（步骤 2）。

1.  使用 QIAseq Library Quant Array Kit 或类似的基于 qPCR 的方法对库进行量化。

图 6. 毛细管电泳设备跟踪数据显示来自 cfDNA 的文库片段的正确大小分布以及不存在接头、接头二聚体或更大的文库片段。

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