6.3.1 甲基化建库

开始前的要点

· 该方案使用 EpiTect Fast Bisulfite Conversion 试剂盒针对亚硫酸氢盐转化的 DNA 进行了优化，但也可用于生成片段平均大小在 200–1500 bp 之间的单链 DNA 的亚硫酸氢盐转化方法。

· 10 pg – 500 ng gDNA（最佳：1–100 ng）样品作为亚硫酸氢盐转化的输入，可用于使用 QIAseq 甲基文库试剂盒生成文库。

· 如果从低输入水平开始，请注意亚硫酸氢盐转化后单链 DNA 的定量将不准确。

· 使用单独的实验室设备（例如移液器、过滤移液器吸头、反应瓶等）避免试剂的 DNA 污染。

· 酶和酶混合物应在冰上解冻。所有其他组件可以在室温 (15–25°C) 下解冻，但解冻后立即置于冰上。

· 如果使用少于 500 pg 的输入，库将显示较低的映射效率。

· 在冰上设置所有反应。

开始前要做的事情

· 解冻 BisU DNA 修复缓冲液 5x 和超低输入连接缓冲液 4X 并置于冰上。

· 准备新鲜的 80% 乙醇。

· 所有缓冲液和试剂在使用前都应涡旋以确保充分混合。

· 所有酶混合物应置于冰上直至使用。

· 对热循环仪进行编程。为了提高速度和便利性，操作步骤的所有孵化步骤都可以预先编程并保存在热循环仪上。

程序
1.  在开始设置反应和试剂混合物之前，使用表 1 和表 2 中描述的操作步骤对热循环仪进行编程。

表 1.  BisU DNA 修复反应的热循环

步	温度	孵化时间
1	30°C	30分钟
2	68°C	15 分钟
3	4°C	抓住

注意：使用带加热盖设置在 75°C 的热循环仪。

表 2.  接头与末端补平片段连接的热循环

步	温度	孵化时间
1	20°C	15 分钟
2	4°C	抓住

注意：使用带盖的热循环仪。

BisU DNA修复反应
2.  在无 RNase 的水中制备 10 pg – 500 ng（最佳：1–100 ng）的亚硫酸氢盐转化 DNA 稀释液。如果 EpiTect Fast 方案和文库制备之间未发生定量，请使用 EpiTect Fast Eluate 的总体积（约 16 µl）。
    注意：在亚硫酸氢盐转化的 DNA 的亚硫酸氢盐转化、脱磺和柱纯化过程中，大约 30-50% 的 DNA 会丢失。请相应地计算 DNA 输入，以从文库制备的最佳输入开始。

3.  根据表 3 在冰上设置 BisU DNA 修复反应混合物，并通过轻轻涡旋混合。保持在冰上直到进一步处理。
    注意：如果处理更多样本，将 BisU 转化的 DNA 稀释到标准体积（例如 20 µl）中，并通过移取 BisU DNA 修复缓冲液、5x 无 RNase 水和 BisU DNA 修复酶来设置 BisU DNA 修复反应预混液混合。扩大所需反应的数量，然后增加 10%。

表 3.  BisU DNA 修复反应设置

零件	体积/反应
BisU DNA 修复缓冲液，5x	10 µl
无 RNase 水	可变
BisU DNA 修复酶混合物	2 µl
BisU 转化的 DNA	可变
总反应体积	50 µl

4.  在冰上将稀释的 BisU DNA 添加到每个 BisU DNA 修复反应混合物中，使反应总体积为 50 µl，然后轻轻涡旋混合。

5.  短暂旋转试管，立即转移到热循环仪并启动编程的 BisU DNA 修复循环程序（表格1）允许片段的双链合成和末端补平。

6.  热循环完成后，将样品置于冰上。

适配器连接
7.  在 BisU DNA 修复循环期间，涡旋并向下旋转适配器板。刺穿板箔密封并在无 RNase 水中稀释接头（表 4）. 

8.  对于接头连接，使用稀释表 4，取决于完整工作流程中的 DNA 输入，包括 EpiTect Fast 亚硫酸氢盐转化。

表 4.  适配器稀释

完整工作流程中的 DNA 输入	在无 RNase 水中的接头稀释
<500 皮克	1:50
500 皮克 – 50 纳克	1:10
>50 纳克	1:2

9.  将 4 µl 一个适配器转移到每个样品中。跟踪使用的条形码并冻结剩余的适配器。

10.  根据在冰上制备结扎预混液表 5。通过轻轻涡旋混合并短暂旋转以收集管底部的液体。

表 5.  连接主混合物设置

零件	体积/反应
超低输入连接缓冲液，4X	25µl
超低输入连接酶	5µl
无核糖核酸酶水	16µl
总反应体积	46µl

注意：扩大所需反应的数量，然后添加 10%。

11.  向每个样品中加入 46 µl 结扎预混液，以产生 100 µl 的总体积。
涡旋混合，然后旋转并放入热循环仪中。

12.  运行编程的连接循环程序（表 2）.  完成连接步骤后，立即对生成的文库进行纯化。

使用 QIAseq Beads 进行文库纯化

13.  向每个样品中加入 50 µl (0.  5x) 混合的 QIAseq Beads 并涡旋。
    注意：如果使用板，为避免在打开密封胶带时造成污染，我们建议通过移液器混合。在每个混合步骤后始终更换移液器吸头。

14.  在室温下孵育 5 分钟，将文库片段结合在珠子上。

15.  将磁珠放在磁力架上，直到上清液清澈（约 5 分钟），然后小心丢弃上清液。

16.  向每个颗粒中加入 200 µl 新鲜的 80% 乙醇，以清洗固定在磁铁上的珠子。

17.  弃去上清液并重复洗涤步骤 16.  重复洗涤步骤后，弃去上清液。小心地从管内壁去除所有剩余的乙醇液滴，因为剩余的乙醇污染可能会抑制后续反应。

18.  在磁力架上孵育 5-10 分钟或直到珠子干燥（视觉控制）。
避免过度干燥，因为这可能会导致 DNA 回收率降低。从磁性支架上取下。

19.  将磁珠重悬于 55 µl 无 RNase 水中进行洗脱。将磁珠放在磁力架上，直到上清液清澈（约 5 分钟）。

20.  小心地将 50 µl 上清液转移到新试管中，然后进行第二次纯化，如下所示

21.  向每个样品中加入 60 µl (1.  2x) QIAseq Beads，混合并按照步骤 14–18 进行操作。

22.  通过在 25 µl 无 RNase 水中重悬珠子进行洗脱。将磁珠放在磁力架上，直到上清液澄清（大约 5 分钟），然后将 20 µl 上清液转移到新的 LoBind 管中。纯化的文库可以储存在 –20°C。

1.  根据制造商的说明，使用表6中给出的条件对热循环仪进行编程。
    注意：文库扩增的循环数会因起始材料而异，应针对每个单独的实验进行估计。表7提供了完整工作流程中不同输入量应使用的循环数的一些建议，从DNA的外延快速亚硫酸氢盐转化开始。

 

表 6. 文库扩增循环条件

步	温度	孵化时间
1	98°C	30 s
2（6-18 个周期）	98°C	5 s
	55°C	10 s
	72°C	15 s
3	72°C	5分钟
4	4°C	抓住

注意：使用带加热盖的热循环仪。

 

表 7. 文库扩增推荐的 PCR 循环数

完整工作流程中的 DNA 输入	PCR 循环数
<500 皮克	16–18
500 皮克– 1 纳克	14
1 纳克– 50 纳克	10
>50 纳克	6

2.  解冻第 22 步中的文库 DNA操作步骤：从亚硫酸氢盐转化的文库生成 脱氧核糖核酸”、5X VeraSeq Buffer II、无 RNase 水、dNTP Mix 和 Illumina 引物混合液，解冻后置于冰上。将 VeraSeq Ultra DNA 聚合酶直接置于冰上。使用前充分混合。在冰上制备反应混合物。

3.  根据制备扩增反应混合物表 8。涡旋混合并向下旋转以收集管底部的液体。

 

表 8. 文库扩增反应混合物

零件	体积/反应
无 RNase 水	17.25µl
5X VeraSeq Buffer II	10µl
dNTP Mix	1.25µl
Illumina底漆混合物	1µl
VeraSeq Ultra DNA 聚合酶	0.5µl
全部的	30µl

注意：扩大所需反应的数量，然后添加 10%。

4.  将 30 µl 扩增混合物添加到 20 µl 文库中（自“方案：从亚硫酸氢盐转化的DNA生成文库”的步骤22），涡旋混合，然后旋转并置于冰上。

5.  将 PCR 管放入热循环仪并启动程序库扩增循环程序（表 7）.

6.  扩增后，样品可以在 2–8°C 下保存过夜，或在 –20°C 下保存更长时间。
使用 QIAseq Beads 进行最终文库纯化

7.  将 55 µl（1.1x 体积）QIAseq Beads 添加到 50 µl 扩增文库中，并通过上下吹打充分混合。

8.  在室温下孵育 5 分钟以在珠子上结合文库片段。

9.  将磁珠放在磁力架上，直到上清液清澈（约 5 分钟），然后小心丢弃上清液。

10.  向每个颗粒中加入 200 µl 新鲜的 80% 乙醇，以清洗固定在磁铁上的珠子。

11.  丢弃上清液并重复洗涤步骤10。

12.  重复洗涤步骤后，弃去上清液。小心地从管内壁去除所有剩余的乙醇液滴，因为剩余的乙醇污染可能会抑制后续反应。

13.  在磁力架上孵育 5-10 分钟或直到珠子变干。避免过度干燥，因为这可能会导致 DNA 回收率降低。从磁性支架上取下。

14.  通过在 25 µl 无 RNase 水中在室温下重悬和孵育珠子 5 分钟来洗脱。

15.  将磁珠放在磁力架上 5 分钟，然后将 20 µl 上清液转移到新的 LoBind 管中。储存在 –20°C 直至测序。

16.  使用毛细管电泳设备或类似方法评估库的质量。检查文库片段的正确大小分布（图 3）以及是否缺少接头或接头二聚体。
    注意：DNA 插入片段的中值大小约为。 250 bp 并应根据与库片段连接的 120 bp 适配器的大小进行移动。
 中间片段大小可用于后续基于 qPCR 的量化方法。

图 3. 生成库的毛细管电泳设备轨迹。毛细管电泳设备跟踪数据显示文库片段的正确大小分布以及不存在接头或接头-二聚体。显示的是从 1 ng 或 10 ng 亚硫酸氢盐转化的 DNA 开始的复制文库。 1 ng 文库扩增 14 个循环，10 ng 文库使用 10 个 PCR 循环扩增。文库按 1:10 稀释并加载到安捷伦高灵敏度 DNA 芯片上。

△点击放大图片