6.4 ChIP测序(ChIP-seq)

进行 ChIP-seq 时，必须生成一个对照 DNA 测序库，用于确定在 ChIP 分析和 DNA 库制备过程中引起的 DNA 富集是否有任何实验偏差。用输入染色质（即用于进行免疫沉淀的染色质）纯化的 DNA 通常用来生成对照 DNA 库。

起始原料：

500pg – 1 μg ChIP DNA。为确保 DNA 测序库的最佳多样性，我们建议在转录因子和辅助因子 ChIP-seq 中使用 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA，在总组蛋白或组蛋白修饰 ChIP-seq 中使用 50 ng 经 ChIP 富集的 DNA，在对照 DNA 测序库中使用 50 ng 输入 DNA。如有必要，在库的生成中使用少于 5 ng 经 ChIP 富集的 DNA，但由于扩增过程中存在 PCR 偏差，这可能会导致库的多样性程度较低。

在开始之前：

· 在室温下解冻 End Prep Enzyme Mix (•)。

· 制备 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）。

1.  用无菌、不含核酸酶的试管制备 0.5-50 ng ChIP DNA 和相对输入 DNA（对照 DNA）。添加 1X TE，让每份 DNA 样品的最终体积为 50 μl。

2.  往每份 DNA 样品中添加 3 μl End Prep Enzyme Mix (•) 和 7 μl End Prep Reaction Buffer (•)，使总反应体积为 60 μl。

3.  上下吹打至少 10 次以彻底混合反应物，并快速旋转一次以收集试管壁上的所有液体。少量气泡并不会干扰实验的进行。

4.  放在热循环仪中，并进行以下流程：
    · 在 20 °C 下保存 30 分钟
    · 在 65 °C 下保存 30 分钟
    · 保持在 4 °C 下

5.  继续进行接头蛋白连接（第二部分）。如有必要，将样品保存在 -20°C 下，但可能会观察到少量产率损失（约 20%）。我们建议在停止之前继续进行接头蛋白连接。

在开始之前：

· Adaptor for Illumina® (•) 和 USER™ 酶 (•) 均可在 Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中找到。

· 在室温下解冻 Adaptor for Illumina® (•)。

· 上下吹打几次以混合 Ligation Master Mix。

· 制备每份样品大约需 2.5 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。

1.  将 Adaptor for Illumina® (•) 在 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中稀释。如果起始 DNA 为 5 ng 至 100 ng，则以 1:10 的比例稀释接头蛋白，以产生 1.5 mM 的使用浓度。如果起始 DNA 少于 5 ng，则以 1:25 的比例稀释接头蛋白，以产生 0.6 mM 的使用浓度。

2.  Add 30 μl Ligation Master Mix (•), 1 μl Ligation Enhancer (•), and 2.5 μl diluted Adaptor for Illumina® directly to the 60 μl End Prep Reaction Mixture from step 5 in Section I.
    Note: Preparing a reaction premix containing the diluted adaptor ahead of time is NOT recommended.

3.  通过上下抽吸至少 10 次彻底混合连接反应，然后进行快速离心以从管侧壁收集所有液体。Ligation Master Mix 极具黏性。应注意确保连接反应物的充分混合，因为混合不完全会导致连接效率降低。少量气泡并不会干扰实验的进行。

4.  在室温下孵育 15 分钟。

5.  添加 3 μl USER™ Enzyme (•) 到连接混合物中。混匀并在 37°C 下孵育 15 分钟，加热盖设置为 ≥ 47°C。

6.  继续清除接头蛋白连接的 ChIP DNA（第三部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下，过夜。

在清除接头蛋白连接的 ChIP DNA 的阶段，不建议进行大小选择，因为它会导致 ChIP-seq DNA 库的产率和多样性急剧下降。

在开始之前：

· 如果用 AMPure® XP beads，则在使用前至少 30 分钟先将磁珠加热至室温。

· 通过管倒置或上下抽吸重悬 AMPure® XP 珠子或 SPRIselect® 珠子。

· 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。

· 制备每份样品需 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。

1.  添加 87 μl (0.9X) 重悬后的 AMPure® XP beads 或 SPRIselect® beads 到每份接头蛋白连接反应物中。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。

2.  在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。

3.  将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。

4.  一旦溶液变澄清，便小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。

5.  在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。

6.  重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。

7.  在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。
    注：请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果磁珠开始破裂，则说明磁珠太干燥。

8.  从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 17 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。

9.  将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。一旦溶液变澄清，便将 15 μl 含有 DNA 靶标的上清液转移到新的 PCR 试管中。继续对接头蛋白连接的 ChIP-DNA 进行 PCR 富集（第四部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。

在开始之前：

· Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 中提供 Universal PCR Primer for Illumina® (•) 和十二种 Index Primers for Illumina® (•)。如与 Single Index Primers (#29580) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index Primer。请参阅 #29580 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。

· Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538 中提供八种 Index 5 Primers for Illumina®（白色盖）和十二种Index 7 Primers for Illumina®（橙色盖）。如与 Dual Index Primers (#47538) 一同使用，则每次 PCR 反应仅需使用一份 Index 5 primer 和一份 Index 7 primer。请参阅 #47538 数据表，了解有效的条形码组合以及设置 PCR 反应的技巧。

· 在室温下解冻引物和纯化的接头蛋白连接的 ChIP DNA 片段（源于第三部分中的步骤 9）。

1.  将以下组分添加到无菌 PCR 试管中：

试剂	1 次 PCR 反应所需的体积 (50 μl)
纯化后的接头蛋白连接的 ChIP DNA 片段（源于第三部分中的步骤 9）	15 μl
Q5® PCR Master Mix (•)	25 μl
Single Index Primer for Illumina® (•)（或编入双重索的 Dual Index 7 Primer for Illumina® [橙色盖子]）	5 μl
Universal PCR Primer for Illumina® (•)（或编入双重索引的 Dual Index 5 Primer for Illumina® [白色盖子]）	5 μl

2.  通过上下抽吸 10 次彻底混合反应物，并进行快速离心以从试管壁收集所有液体。

3.  将试管放在热循环仪上，并在以下 PCR 循环条件下进行 PCR 扩增：

a.	初始变性	98°C 30 秒
b.	变性	98°C 10 秒
c.	退火和延伸	65°C 15 秒
d.	如果起始原料为 50 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 6 次。 如果起始原料为 5 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 10 次。 如果起始原料为 0.5 ng ChIP DNA，则重复步骤 b 和 c，共循环 13 次。
e.	终末延伸	65°C 3 分钟
f.	保持	4°C

4.  继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止）或者，将样品保存在 -20°C 下。

在开始之前：

· 如果用 AMPure® XP beads，则在使用前至少 30 分钟先将磁珠加热至室温。

· 通过管倒置或上下抽吸重悬 AMPure® XP 珠子或 SPRIselect® 珠子。

· 制备每份样品需 400 μl 80% 乙醇。

· 制备每份样品大约需 40 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）。

1.  将 45 μl (0.9X) 重悬后的 AMPure® XP beads 或 SPRIselect® beads 添加到 50 μl 在第四部分步骤 4 中制备的 PCR 反应物中。上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中，注意将所有液体排出吸头。

2.  在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。

3.  将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让磁珠与上清液分离。

4.  小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。

5.  在将试管/平板放在磁力架中时，将新鲜制备的200 μl 80% 乙醇添加到试管/平板中。在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意不要扰乱含有 DNA 靶标的磁珠。

6.  重复步骤 5 一次，共进行两次洗涤。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。

7.  在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让磁珠风干长达 5 分钟。
    注：请勿过度风干磁珠。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。在磁珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。如果磁珠开始破裂，则说明磁珠太干燥。

8.  从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 33 μl 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5），以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。上下吹打 10 次以混匀。在室温孵育至少 2 分钟。

9.  将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。将 30 μl 含有 DNA 靶标的上清液小心地转移到新试管中。（安全停止）可将库保存在 -20°C 下。

10.  通过 Nanodrop 或 Picogreen 检测来测定 DNA 库的浓度。DNA 库的浓度应为 10-40 ng/μl。

11.  使用 10mM Tris-HCl 将 1 μl DNA 库稀释至最终浓度为 5-10 ng/μl。根据制造商的说明，用 Agilent Bioanalyzer® High Sensitivity DNA 芯片来确定稀释后 DNA 库的大小分布。

12.  如果观察到接头蛋白二聚物（Single Index Primer 约 128 bp 或 Dual Index Primers 约 146 bp）污染，则重复清除步骤 1-10。残留的适配体和/或适配体二聚物会严重污染测序反应。

13.  使用 10mM Tris-HCl 稀释最终纯化的库样品，以进行高通量测序。请参阅 Illumina® 测序手册，了解 NG-seq 所需的 DNA 库的最佳浓度和体积。