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6.6.2 单细胞RNA建库

| 6.7 BD 单细胞建库

如下操作步骤以产品货号180733的步骤为例，产品列表详见右下方推荐产品

实验步骤

从单细胞中扩增 Poly A+ mRNA

要从单细胞材料中扩增总 RNA，请使用“从单细胞中扩增总 RNA”的方案。对于纯化总 RNA 或富集 mRNA 的全转录组扩增，请使用“纯化 RNA 扩增”方案。

开始前的要点
· 该方案针对所有脊椎动物物种（例如，人类、小鼠、大鼠、分选细胞、组织培养细胞、显微镜下挑选的细胞或冷冻组织的显微切割细胞）的细胞（1-1000 个细胞）进行了优化。

· 该操作步骤不能用于细菌细胞。植物细胞或其他含有细胞壁的细胞和生物体也不适合。对于这些起始材料，首先纯化 RNA，然后使用“纯化 RNA 扩增”操作步骤进行 WTA。

· 该方案不能用于用福尔马林或其他交联剂处理的固定细胞（例如，通过激光显微切割从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中获得的单细胞样本）。

· 使用 QIAseq FX Single Cell RNA Library Kit 的 1–1000 个完整细胞（例如人类或细胞培养细胞）的样本是全转录组扩增反应的最佳选择。避免在反应中使用超过 1000 个细胞，因为含有过多细胞的样品可能无法有效裂解。

· 通过使用单独的实验室设备（例如移液器、过滤移液器吸头、反应瓶等）避免试剂的任何 DNA 或 RNA 污染。在没有核酸的位置设置单细胞反应。

· 在无模板对照 (NTC) 中随机延伸引物（引物-多聚体形成）可能产生的高分子量 DNA 不包含遗传信息，不会影响下游应用的质量。在含有活细胞和足够 cDNA 的反应中，不会形成这些产物。

· 由于 QIAseq FX Single Cell RNA Library Kit 旨在从最少量的起始 RNA 中生成扩增的 cDNA，因此请务必采取适当的措施以避免无意中引入 RNase 污染。在使用 RNA 时，遵循适当的微生物学和无菌技术，创建和维护一个无 RNase 的环境。强烈建议使用刚打开的盒子或袋子中的一次性塑料管和移液器吸头。

· 用于全转录组扩增的试剂不适用于小 RNA 分子的扩增，例如 tRNA 或 miRNA。

· 请注意，最终反应体积为 59 μl。

· 尽管所有序列都得到了很好的表现，但扩增的 cDNA 并不包含全长 cDNA。扩增过程由随机引发的 cDNA 合成开始。因此，转录序列被分段扩增。由于连接反应的性质，DNA 片段可能不会按照它们最初存在于生物体中的顺序组装。然而，试剂盒化学旨在使这些事件变得罕见，因此核酸序列的检测和定量不受影响（例如，序列多态性、差异表达分析）。

开始前要做的事情
· 方案中描述的 Quantiscript RT 混合物、连接混合物和 REPLI-g SensiPhi 扩增混合物必须始终新鲜制备。它们不能储存以备后用。

· 所有缓冲液和试剂在使用前都应涡旋以确保充分混合。

· Quantiscript RT Enzyme Mix、Ligase Mix 和 REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase 应在冰上解冻。所有其他组件都可以在室温 (15–25°C) 下解冻。

· 为了提高速度和便利性，操作步骤的所有孵育步骤都可以在热循环仪上进行预编程（表 1）。

表 1. 热循环参数

步骤	时间	温度	附加评论
将所有步骤的加热盖设置为 50ºC
细胞裂解	5分钟	24ºC	添加裂解缓冲液（步骤 2）
	3 分钟	95ºC
	∞	4ºC	抓住
gDNA 去除	10 分钟	42ºC	孵育前添加 gDNA Wipeout Buffer（步骤 4）
gDNA 去除	∞	4°C	抓住
逆转录	60 分钟	42ºC	孵育前添加 Quantiscript RT 混合物（步骤 6）
	3 分钟	95°C	停止逆转录
	∞	4ºC	抓住
结扎	30分钟	24ºC	孵育前添加连接混合物（步骤 8）
	5分钟	95°C	停止连接
	∞	4ºC	抓住
全转录组放大	2 h	30ºC	孵化前添加 REPLI-g SensiPhi 扩增混合物（步骤 10）
	5分钟	65ºC	灭活所有酶
	∞	4ºC	冷却扩增的 cDNA

程序
1. 将 7 μl 细胞材料（与 PBS 一起提供）放入微量离心管中。如果使用少于 7 μl 的细胞材料，添加 H20 sc 使体积达到 7 μl。
注意：立即进行第 2 步。

2. 添加 4 μl 裂解缓冲液。轻轻轻弹试管小心混合，然后短暂离心。
注意：确保细胞材料不会粘在半月板上方的管壁上，并且裂解缓冲液与细胞材料的混合是完全的。

3. 在 24°C 下孵育 5 分钟，然后在 95°C 下孵育 3 分钟。冷却至 4°C。

4. 加入 2 μl gDNA Wipeout Buffer，涡旋混合并短暂离心。

5. 在 42°C 下孵育 10 分钟。如果需要更多时间来准备下一步，请放在冰上。

6. 准备 Quantiscript RT 组合（表 2）。向裂解的细胞样品中加入 6 μl Quantiscript RT Mix，涡旋混合并短暂离心。
注意：Quantiscript RT 混合物必须新鲜制备。

表 2. Quantiscript RT 混合物的制备*

零件	体积/反应
RT/聚合酶缓冲液	4微升
寡核苷酸引物	1微升
Quantiscript RT 酶混合物	1微升
总音量†	6微升

* 要为多个反应制备 Quantiscript RT 混合液，请根据反应数量扩大规模。
通过涡旋和短暂离心混合。

7. 在 42ºC 下孵育 60 分钟。通过在 95ºC 下孵育 3 分钟来停止反应，然后在冰上冷却。

8. 准备结扎组合（表 3）。将 10 μl 连接混合物添加到步骤 7 的 RT 反应中。通过涡旋和短暂离心混合。
重要提示：制备连接混合物时，请按表 3 中所示的顺序添加组分。
注意：连接混合物必须新鲜制备。

表 3. 连接混合物的制备*

零件	体积/反应
连接酶缓冲液	8微升
连接酶混合物	2微升
总音量†	10微升

* 要为多个反应制备连接混合物，请根据反应次数放大。
通过涡旋和短暂离心混合。

9. 在 24ºC 下孵育 30 分钟。通过在 95°C 下孵育 5 分钟来停止反应，然后在冰上冷却。

10. 准备 REPLI-g SensiPhi 放大组合（表 4）。将 30 μl REPLI-g SensiPhi 扩增混合物添加到步骤 9 的连接反应中。通过涡旋和短暂离心混合。
注意：REPLI-g SensiPhi 扩增混合物必须新鲜制备。

表 4. REPLI-g SensiPhi 扩增混合物的制备*

零件	体积/反应
REPLI-g sc 反应缓冲液	29微升
REPLI-g SensiPhi DNA 聚合酶	1微升
总音量†	30微升

* 要为多个反应制备 REPLI-g SensiPhi 扩增混合物，请根据反应数量进行放大。
通过涡旋和短暂离心混合。

11. 在 30ºC 下孵育 2 小时。

12. 通过在 65ºC 下孵育 5 分钟来停止反应，然后在冰上冷却。

13. 如果不直接使用，将扩增的 cDNA 储存在 –15ºC 至 –30ºC 直至下游应用需要。我们建议以 100 ng/μl 的最低浓度储存扩增的 DNA。
注意：在无模板对照（NTC）中通过引物随机延伸（引物-多聚体形成）产生的高分子量 DNA 不包含遗传信息，不会影响下游应用的质量。这些产品被 WTA 期间存在的活细胞的 cDNA 竞争。

14. 扩增后的 cDNA 可直接用于文库构建，也可用于靶向扩增和文库构建。扩增的 cDNA 与纯化的基因组 DNA 相似，长度约为 2,000–70,000 bp。
注意：如果需要对扩增的 cDNA 进行量化，请按照附录 B 中的说明进行操作。光密度 (OD) 测量会高估第 12 步中的扩增 cDNA，因此不应使用。

附录内容可在QIAGEN官网下载货号为180733的完整说明书进行了解。

从单细胞中扩增总 RNA

该方案用于从单细胞材料中扩增总 RNA。请注意，rRNA 也使用此操作步骤进行放大，并且在放大后将代表所有 cDNA 的高百分比，因此在结果数据集中读取的百分比很高。为了富集包括 mRNA 在内的多聚腺苷酸化 RNA，我们建议使用“从单细胞中扩增 Poly A+ mRNA”的方案，该方案可避免 rRNA 的扩增并生成非常适合 NGS 的 cDNA。对于纯化 RNA 的全转录组扩增，请参阅“纯化 RNA 的扩增”方案。

· 该操作步骤不能用于细菌细胞。植物细胞或其他含有细胞壁的细胞也不适合。对于这些起始材料，首先纯化 RNA，然后使用“纯化 RNA 扩增”操作步骤进行 WTA。

· 该方案不能用于用福尔马林或其他交联剂处理的固定细胞（例如，通过激光显微切割从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中获得的单细胞样本）。

· 使用 QIAseq FX 单细胞 RNA 文库试剂盒，1–1000 个完整细胞（例如人类或细胞培养细胞）的样本是全转录组扩增和后续文库制备的最佳选择。避免在反应中使用超过 1000 个样品，因为含有过多细胞的样品可能无法有效裂解。

· 通过使用单独的实验室设备（例如移液器、过滤移液器吸头、反应瓶等）避免试剂的任何 DNA 或 RNA 污染。在没有核酸的位置设置 REPLI-g 单细胞反应。

· 在无模板对照 (NTC) 中随机延伸引物（引物-多聚体形成）产生的高分子量 DNA 不包含遗传信息，不会影响下游应用的质量。这些产品被 WTA 期间存在的活细胞 DNA 所取代。

· 由于 QIAseq FX Single Cell RNA Library Kit 旨在从最少量的起始 RNA 中生成扩增的 cDNA，因此请采取适当的措施以避免无意中引入 RNase 污染。通过遵循适当的微生物学和无菌技术，在处理 RNA 时创建和维持无 RNase 的环境。强烈建议使用刚打开的盒子或袋子中的一次性塑料管和移液器吸头。

· 用于全转录组扩增的试剂不适用于小 RNA 分子的扩增，例如 tRNA 或 miRNA。

开始前要做的事情
· 方案中描述的 Quantiscript RT 混合物、连接混合物和 REPLI-g SensiPhi 扩增混合物必须始终新鲜制备。它们不能储存以备后用。

· 所有缓冲液和试剂在使用前都应涡旋以确保充分混合。

· Quantiscript RT Enzyme Mix、Ligase Mix 和 REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase 应在冰上解冻。所有其他组件都可以在室温 (15–25°C) 下解冻。

· 为了提高速度和便利性，操作步骤的所有孵育步骤都可以在热循环仪上进行预编程（表 5）。

表 5. 热循环参数

步	时间	温度	附加评论
将所有步骤的加热盖设置为 50ºC
细胞裂解	5分钟	24ºC	添加裂解缓冲液（步骤 2）
	3 分钟	95ºC
	∞	4ºC	抓住
gDNA 去除	10 分钟	42ºC	孵育前添加 gDNA Wipeout Buffer（步骤 4）
gDNA 去除	∞	4°C	抓住
逆转录	60 分钟	42ºC	孵育前添加 Quantiscript RT 混合物（步骤 6）
	3 分钟	95°C	停止逆转录
	∞	4ºC	抓住
结扎	30分钟	24ºC	孵育前添加连接混合物（步骤 8）
	5分钟	95°C	停止连接
	∞	4ºC	抓住
全转录组放大	2 h	30ºC	孵化前添加 REPLI-g SensiPhi 扩增混合物（步骤 10）
	5分钟	65ºC	灭活所有酶
	∞	4ºC	抓住

程序
1. 将 7 μl 细胞材料（与 PBS 一起提供）放入微量离心管中。如果使用少于 7 μl 的细胞材料，添加 H20 sc 使体积达到 7 μl。

2. 添加 4 μl 裂解缓冲液。轻轻轻弹试管小心混合，然后短暂离心。
注意：确保细胞材料不会粘在半月板上方的管壁上。

3. 在 24°C 下孵育 5 分钟，然后在 95°C 下孵育 3 分钟。冷却至 4°C。

4. 加入 2 μl gDNA Wipeout Buffer，涡旋混合并短暂离心。

5. 在 42°C 下孵育 10 分钟。如果需要更多时间来准备下一步，请放在冰上。

6. 准备 Quantiscript RT 组合（表 6）。向裂解的细胞样品中加入 7 μl Quantiscript RT mix，涡旋混合并短暂离心。
注意：Quantiscript RT 混合物必须新鲜制备。

表 6. Quantiscript RT 混合物的制备*

零件	体积/反应
RT/聚合酶缓冲液	4微升
随机引物	1微升
寡核苷酸引物	1微升
Quantiscript RT 酶混合物	1微升
总音量†	7微升

8. 准备结扎混合物（表 7）。将 10 μl 连接混合物添加到步骤 7 的 RT 反应中。通过涡旋和短暂离心混合。
重要提示：制备连接混合物时，请按表 7 中所示的顺序添加组分。
注意：连接混合物必须新鲜制备。

表 7. 连接混合物的制备*

零件	体积/反应
连接酶缓冲液	8微升
连接酶混合物	2微升
总音量†	10微升

* 要为多个反应制备连接混合物，请根据反应次数放大。
通过涡旋和短暂离心混合。

9. 在 24ºC 下孵育 30 分钟。通过在 95°C 下孵育 5 分钟来停止反应，然后在冰上冷却。

10. 准备 REPLI-g SensiPhi 放大组合（表 8）。将 30 μl REPLI-g SensiPhi 扩增混合物添加到步骤 9 的连接反应中。通过涡旋和短暂离心混合。
注意：REPLI-g SensiPhi 扩增混合物必须新鲜制备。

表 8. REPLI-g SensiPhi 扩增混合物的制备*

零件	体积/反应
REPLI-g sc 反应缓冲液	29微升
REPLI-g SensiPhi DNA 聚合酶	1微升
总音量†	30微升

* 要为多个反应制备 REPLI-g SensiPhi 扩增混合物，请根据反应数量进行放大。
通过涡旋和短暂离心混合。

11. 在 30ºC 下孵育 2 小时。

12. 通过在 65ºC 下孵育 5 分钟来停止反应，然后在冰上冷却。

13. 如果不直接使用，将扩增的 cDNA 储存在 –15 ºC 至 –30ºC 直至下游应用需要。我们建议以 100 ng/μl 的最低浓度储存扩增的 cDNA。
注意：在无模板对照（NTC）中通过引物随机延伸（引物-多聚体形成）产生的高分子量 DNA 不包含遗传信息，不会影响下游应用的质量。这些产物被 MDA 期间存在的活细胞产生的 cDNA 竞争。

14. 扩增后的 cDNA 可直接用于文库构建，也可用于靶向扩增和文库构建。扩增的 cDNA 与纯化的基因组 DNA 相似，长度约为 2000–70,000 bp。
注意：如果需要对扩增的 cDNA 进行量化，请按照附录 B 中的说明进行操作。光密度 (OD) 测量会高估第 12 步中的扩增 DNA，因此不应使用。

3

纯化 RNA 的扩增

开始前的要点
· 该方案可应用于任何类型的纯化 RNA，例如总 RNA、poly A+ RNA（使用 GeneRead Pure mRNA 试剂盒）或 rRNA 耗尽的 RNA（使用 GeneRead rRNA Depletion 试剂盒）。它不适用于降解的 RNA，例如来自 FFPE 组织的 RNA。

· 用于纯化 RNA 的 WTA 的具体方案取决于起始材料和下游应用。

· 使用 50 pg – 100 ng 的纯化 RNA 进行 WTA 实验。

· 通过使用单独的实验室设备（例如移液器、过滤移液器吸头、反应瓶等）避免试剂的任何 DNA 或 RNA 污染。在没有核酸的位置设置 REPLI-g 单细胞反应。

· 在无模板对照 (NTC) 中随机延伸引物（引物-多聚体形成）产生的高分子量 DNA 不包含遗传信息，不会影响下游应用的质量。这些产品被 WTA 期间存在的活细胞 DNA 所取代。

· 由于 QIAseq FX Single Cell RNA Library Kit 旨在从最少量的起始 RNA 中生成扩增的 cDNA，因此请采取适当的措施以避免无意中引入 RNase 污染。通过遵循适当的微生物学和无菌技术，在处理 RNA 时创建和维持无 RNase 的环境。强烈建议使用刚打开的盒子或袋子中的一次性塑料管和移液器吸头。

· 用于全转录组扩增的试剂不适用于小 RNA 分子的扩增，例如 tRNA 或 miRNA。

· 尽管所有序列都得到了很好的表现，但扩增的 cDNA 并不包含全长 cDNA。扩增过程由随机引物和寡 dT - 引物 cDNA 合成开始。因此，转录序列被分段扩增。由于连接反应的性质，DNA 片段可能不会按照它们最初存在于生物体中的顺序组装。然而，试剂盒化学旨在使这些事件变得罕见，因此在下游 NGS 应用中核酸序列的检测不受影响（例如，多态性）。

开始前要做的事情
· 方案中描述的 Quantiscript RT 混合物、连接混合物和 REPLI-g SensiPhi 扩增混合物必须始终新鲜制备。它们不能储存以备后用。

· 所有缓冲液和试剂在使用前都应涡旋以确保充分混合。

· Quantiscript RT Enzyme Mix、Ligase Mix 和 REPLI-g SensiPhi DNA Polymerase 应在冰上解冻。所有其他组件都可以在室温 (15–25°C) 下解冻。

· 为了提高速度和便利性，操作步骤的所有孵育步骤都可以在热循环仪上进行预编程。使用与起始材料对应的操作步骤中列出的循环参数。

程序
1. 将 8 μl 纯化的 RNA (>50 pg) 放入微量离心管中。如果使用少于 8 μl 的纯化 RNA，添加 H20 sc 使体积达到 8 μl。

2. 加入 3 μl NA 变性缓冲液，涡旋混合并短暂离心。

3. 在 95°C 下孵育 3 分钟，然后冷却至 4°C。

4. 继续执行“从单细胞扩增 Poly A+ mRNA”或“从单细胞扩增总 RNA”操作步骤的第 4 步。

使用 QIAseq FX 单细胞扩增 cDNA 进行酶促片段化和文库制备

开始前的要点
· 该操作步骤用于使用 QIAseq FX Single Cell DNA Library Kit 为 Illumina NGS 平台构建测序文库。

· 该方案还需要以下 QIAGEN 产品：对于反应净化和文库构建后接头二聚体的去除，Agencourt AMPure XP Beads（货号 A63880、A63881）或 GeneRead Size Selection Kit（货号 180514）是需要，应单独订购。

· 扩增的 cDNA 在开始前应在 H₂O 中稀释。

开始前要做的事情
· 程序周期。为了提高速度和便利性，操作步骤的所有孵育步骤都可以预先编程并保存在热循环仪上（表 5）。
请参阅表 5 以确定将输入 DNA 片段化为所需大小所需的时间和方案。

· 准备新鲜的 80% 乙醇。

· 制备缓冲液 10 mM Tris-HCl，pH 8.0

· 程序热循环仪。为了提高速度和便利性，操作步骤的所有孵化步骤都可以预先编程和保存。

程序：酶裂解和文库制备

FX 单管碎裂、末端修复和A-加法
1. 在冰上解冻所有套件组件。一旦试剂解冻，通过快速涡旋彻底混合缓冲液以避免任何局部浓度。使用前短暂旋转涡旋试剂。根据表 9 对热循环仪进行编程并启动程序。如果可能，将加热盖的温度设置为 ~70°C。

2. 当热循环仪模块达到 4°C 时，暂停程序。

表 9. 扩增的 cDNA 片段化反应条件

步	温度	孵育时间（片段大小 300 bp）	孵育时间（片段大小 500 bp）
1	4°C	1分钟	1分钟
2	32°C	15 分钟*	10 分钟
3	65°C	30分钟	30分钟
4	4°C	抓住	抓住

*已完成文库的插入片段大小由步骤 2 的持续时间决定。使用 200–1000 ng 输入 DNA，如果使用 FX 增强剂，15 分钟的片段化时间会产生约 300 bp 的片段分布，如果使用此组件，则为 500 bp被省略。可以通过改变第 2 步的持续时间来调整片段大小。使用带加热盖的热循环仪。

3. 在 H2O sc 中稀释扩增的 cDNA 1:3。这应该在 10 μl H2O sc (50-100 ng/μl) 中得到 500 – 1000 ng 总扩增 DNA。如果您已对 cDNA 进行了定量，则在 FX 反应中输入的未稀释 cDNA 不得超过 5 μl。在 PCR 管或条带中吸取 10 μl 稀释的 DNA，并将它们放在冰或冷却块上。

4. 如果所需的库片段大小为 300 bp，则根据表 10 在冰上制备 FX 反应混合物，或根据表 11 制备 500 bp 的库片段大小并通过移液混合。按照表中所述的相同顺序添加 FX Reaction Mix 的组分。在添加 FX 酶混合物之前，用移液器上下移液器混合物。您可以根据处理的样本数量扩大 FX Reaction Mix。

表 10. 300 bp 插入片段大小的 FX 反应设置

零件	体积/反应*
FX 缓冲器，10x	5微升
水蒸汽	20微升
效果增强器	5微升
FX 酶混合物	10微升
总反应体积	40微升

* 通过移液器混合，并保持在冰上。

表 11. 500 bp 插入片段大小的 FX 反应设置

零件	体积/反应*
FX 缓冲器，10x	5微升
水蒸汽	25微升
FX 酶混合物	10微升
总反应体积	40微升

* 通过移液器混合，并保持在冰上。

5. 将 40 μl FX Reaction Mix 添加到冰上每个稀释的扩增 cDNA 样品中，轻轻涡旋混合。

6. 短暂旋转 PCR 板/管，立即转移到预冷的热循环仪 (4°C) 并恢复程序。碎片程序完成后，将样品转移到冰上。

7. 立即按照下一个操作步骤中的说明进行适配器连接。

适配器连接
8. 使用前在室温下平衡 Agencourt AMPure XP 微珠 20-30 分钟。

9. 涡旋并向下旋转适配器板。取下保护性适配器板盖，小心地刺穿箔密封并将 5 μl 从一个 DNA 适配器孔转移到前一个方案中的每个 50 μl 样品中。跟踪用于每个样品的条形码。

10. 更换适配器板盖并冷冻未使用的适配器。转接板在至少 10 次冻融循环中是稳定的。
重要提示：每个连接反应只能使用一个接头。如果使用其他供应商的适配器，请遵循制造商的说明。

11. 根据表 12 在冰上的单独试管中制备连接预混液（每个 DNA 样品）。充分混合或在低转速下轻轻涡旋。

表 12. 连接预混液（每个样品）

零件	体积/反应*
DNA 连接酶缓冲液，5x	20微升
H2Osc	15微升
DNA连接酶	10微升
总反应体积	45微升

* 通过移液器混合，并保持在冰上。

12. 在每个样品中加入 45 μl 的连接预混液。充分混合并在 20°C 下孵育 15 分钟。
重要提示：请勿使用带加热盖的热循环仪。

13. 使用 0.8x (80 μl) Agencourt AMPureXP 珠子立即进行接头连接清理（步骤 14–23）。

14. 将 80 μl 重悬的 Agencourt AMPure XP 珠浆添加到每个连接的样品中，并通过移液器或轻轻涡旋充分混合。

15. 在室温下孵育混合物 5 分钟。

16. 将磁珠放在磁性支架上 2 分钟，然后小心丢弃上清液。

17. 通过向每个颗粒中加入 200 μl 新鲜的 80% 乙醇来清洗磁珠。将磁珠放在磁力架上 2 分钟，然后小心丢弃上清液。

18. 重复洗涤步骤 17 一次，总共进行 2 次乙醇洗涤。

19. 在磁力架上孵育 5-10 分钟或直到珠子变干。避免过度干燥，这可能会导致 DNA 回收率降低。从磁性支架上取下。

20. 通过重悬于 52.5 μl 10 mM Tris-HCl，pH 8.0 中进行洗脱。磁力架上的颗粒珠。小心地将 50 μl 上清液转移到新的 PCR 板上。

21. 进行第二次纯化。向每个样品中加入 50 μl 重悬的 1x Agencourt AMPure XP 微珠并混合。

22. 按照步骤 15–19。

23. 通过重悬于 26 μl 10 mM Tris-HCl，pH 8.0 中进行洗脱。将磁珠放在磁力架上。小心地将 23.5 μl 上清液转移到新的 PCR 板中。将纯化的文库储存在 –20°C 直至准备好进行测序。

24. 使用毛细管电泳装置或其他类似方法评估库的质量。检查库片段的正确大小分布（图 2）以及是否缺少适配器或适配器二聚体。
注意：DNA 片段的中值大小应根据与文库片段连接的接头的大小（例如，对于 GeneRead Adapter I Set 1-plex 或 GeneRead Adapter I Set 12-plex，添加 120 bp ）。
注意：中间片段大小可用于后续基于 qPCR 的量化方法。这个中值大小可以在扩增文库和无 PCR 文库之间移动大约 100 倍。 30 个基点。

图 2. 生成库的毛细管电泳设备轨迹。毛细管电泳设备跟踪数据显示 4 个复制完成的文库的正确大小分布以及不存在接头或接头二聚体。

△点击放大图片

25. 使用 QIAseq Library Quant Assay Kit（产品编号 333314，单独出售）或其他类似方法对文库进行量化。
注意：强烈建议通过 qPCR 进行文库定量，以确保准确的文库稀释和聚类，最大限度地提高通过过滤器读取。毛细管电泳或 Qubit®测量可能会高估文库数量，因为它们无法区分可测序文库片段与仅包含一个接头的插入片段。
使用 200 ng – 1 μg WTA cDNA 输入，应生成足够的文库用于在 Illumina 平台上进行测序，而无需进一步 PCR 扩增（图 3）。

图 3：文库产量与 WTA DNA 输入的对比。绘制的数据是用 SD 进行三次反应的手段。

△点击放大图片

26. 纯化后的文库可在 –20°C 下安全储存，直至需要。

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