实验步骤
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开始前的要点
· 该实验方案涵盖了从“标准 RNA”（即细胞或组织）制备 Illumina 测序仪文库所需的所有程序。
· 在设置反应之前，准确确定输入 RNA 的量 (10–1000 ng) 至关重要。我们建议使用 200 ng 总 RNA。较低的输入量是可能的；然而，这将导致更少的 UMI 测序和低丰度克隆型的检测减少。
· 在冰上建立反应。
· 不要涡旋任何试剂或反应。 -
RT 引物杂交
1. 使用加热盖（设置为 103°C）将热循环仪预热至 65°C。
2. 在冰上解冻 RNA 样本。轻轻混合，短暂离心以收集管壁上的残留液体，然后放回冰上。
3. 准备 RT 引物杂交所需的试剂。
3a.如果需要，在室温下解冻 TCR RT 底漆。3b.轻弹试管进行混合，然后短暂离心。
4. 在冰上，按照中所述准备 RT 引物杂交反应表3。短暂离心，上下吹打 7 至 8 次混合（不要涡旋），然后再次短暂离心。表 3. RT 引物杂交反应的制备
零件 1 个反应 RNA 样品 (10–1000 ng) 可变 TCR RT 引物 1 µl 无核酸酶水 可变 全部的 6µl
5. 将管子从冰上转移到预热的热循环仪上，在 65°C 下孵育 5 分钟，然后在冰上孵育至少 2 分钟。
6. 完成后，立即进行“实验方案：逆转录”. -
逆转录
开始前的要点
· RT引物杂交”中的6µl产品是本方案的起始材料。具体页数可从QIAGEN官网下载货号为333705的完整说明书进行了解。
· 在冰上建立反应。
· 不要涡旋任何试剂或反应。
程序：逆转录
7. 准备逆转录所需的试剂。
7a.如果需要，在室温下解冻 BC3 缓冲液，5x。7b.轻弹试管进行混合，然后短暂离心。
注意：RNase Inhibitor 和 EZ Reverse Transcriptase 应从使用前冷冻并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。
8. 在冰上，按照表 4中所述准备逆转录反应。短暂离心，上下吹打 7 至 8 次混合（不要涡旋），然后再次短暂离心。表 4. 逆转录反应的制备
零件 1 反应 RT 引物杂交反应（已在试管中） 6 µl BC3 缓冲液，5x 2 µl 核糖核酸酶抑制剂 1 µl EZ 逆转录酶* 1 µl 全部的 10 µl *当 RNA 量≤20 ng 时，使用 4 µl 无核酸酶水将 1 µl EZ Reverse Transcriptase 稀释至 5 µl。吸管上下 7 至 8 次以混合。然后，向反应中加入 1 µl。
9. 根据表5，在带有加热盖（103°C）的热循环仪中孵育试管。表 5. 逆转录反应的热循环仪设置
步 温度 时间 1 42°C 30分钟 2 70°C 15 分钟 3 4°C 抓住
10. 完成后，继续“实验方案：第二链合成”。或者，可以将样品储存在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中。 -
第二链合成
开始前的要点
· 逆转录”中的10µl产品是本方案的起始材料。具体页数可从QIAGEN官网下载货号为333705的完整说明书进行了解。
· 在冰上建立反应。
· 不要涡旋任何试剂或反应。
程序：第二链合成
11. 准备第二链合成所需的试剂。
11a.在室温下解冻 XC Buffer 和 dNTP。11b.轻弹试管混合，然后短暂离心。
注意：RH RNase 和 BX Enzyme 都应在使用前从冰箱中取出并放在冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。
12. 在冰上，按照中所述准备第二链反应表 6。短暂离心，上下吹打 7 至 8 次混合（不要涡旋），然后再次短暂离心。表 6. 第二链合成反应的制备组分
零件 1 反应 逆转录反应（已在试管中） 10µl XC 缓冲液 2 µl RH 核酸酶 1 µl dNTP 1 µl BX酶 1 µl 无核酸酶水 5 µl 全部的 20µl
13. 根据表 7 在带有加热盖 (103°C) 的热循环仪中孵育试管。表 7. 第二链合成的热循环仪设置
步 温度 时间 1 37°C 7 分钟 2 65°C 10 分钟 3 80°C 10 分钟 4 4°C 抓住
14. 完成后，继续“实验方案：末端修复和A-添加”. -
末端修复和A-添加
开始前的要点
· 来自“实验方案：第二链合成”，整个 20 µl 产品是该方案的起始材料，具体页数可从QIAGEN官网下载货号为333705的完整说明书进行了解。
· 在冰上建立反应。
· 不要涡旋任何试剂或反应。
程序：端修加A
15. 准备末端修复和加 A 所需的试剂。15a.在室温下解冻 ERA 缓冲液，10x。
15b.轻弹试管混合，然后短暂离心。
注意：ERA 酶应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。
16.在冰上，按照表 8中所述准备末端修复和 A 加成反应。短暂离心，上下吹打 7 至 8 次混合（不要涡旋），然后再次短暂离心。表 8. 末端修复和 A 加成反应的制备
零件 1 反应 上一节的二链产物 20µl ERA Buffer，10x 5µl 无核酸酶水 15µl 全部的 40µl
17. 在冰上，向每个反应中加入 10 µl ERA 酶。短暂离心，上下吹打 7 至 8 次混合（不要涡旋），然后再次短暂离心。
重要提示：在整个反应设置过程中，将反应保持在冰上。
18. 根据表 9。将加热的盖子设置为 70°C。
注意：如果使用非温度控制的盖子，在第 4 步打开循环仪盖子的情况下运行，并密封条带或板。当循环仪到达第 5 步时，关闭盖子以避免蒸发。运行后离心以去除任何冷凝物。
19. 在将管/板添加到热循环仪之前，启动程序。当热循环仪达到 4°C 时，暂停程序。
重要提示：热循环仪必须预先冷却并在 4°C 时暂停。
20. 将步骤 17 中准备的管/板转移到预冷的热循环仪并恢复循环程序。表 9. 末端修复和 A-添加的热循环仪设置
步 温度 时间 1 4°C 1分钟 2 20°C 30分钟 3 65°C 30分钟 4 4°C 抓住
21. 完成后，立即进行“实验方案：适配器连接”. -
适配器连接
开始前的要点
· “实验方案：末端修复和A-添加”中的50µl产品是本方案的起始材料，具体页数可从QIAGEN官网下载货号为333705的完整说明书进行了解。
· 在冰上建立反应。
· 不要涡旋任何试剂或反应。
QIAseq 96-Unique 双标签组转接板· 重要提示：QIAseq 96-Unique Dual Index Set Adapter Plate (UDIN-96#A)：适配器连接反应中使用的 A orB 必须与匹配的 QIAseq 配对96-Unique Dual Index Set (UDIS-96#K) Primer Plate：A 或 B 用于通用 PCR 扩增反应。
· QIAseq 96-Unique Dual Index (UDIN-96#A) 接头密封在 96 孔板中，带有可刺穿的铝热封膜。
· 可刺穿的铝封无需拆下；取而代之的是，使用标准 200 µl 移液器吸头刺穿薄膜，以取出适当的适配器和适配器体积。
· 使用前将适配器板在冰上解冻或储存在 4°C。完全解冻后，将板以 1000 g 离心 1 分钟。
QIAseq 12-Index I 接头· 重要提示：QIAseq 12-Index I Adapters (IL-N7##) 在单独的试管中
· 使用前将管在冰上解冻或储存在 4°C。试管完全解冻后，向下旋转试管。
QIAseq 96-Index I Set 转接板· 重要提示：用于接头连接反应的 QIAseq 96-Index I Set Adapter Plate (IL-7##NJ)：A、B、C 或 D 必须与匹配的 QIAseq 96-Index I (IL-5# #SK) Primer Plate：用于通用 PCR 扩增反应的 A、B、C 或 D。
· QIAseq 96-Index I Set (IL-7##NJ) 适配器密封在需要移除密封的 96 孔板中。
· 使用前将适配器板在冰上解冻或储存在 4°C。完全解冻后，将板以 1000 g 的速度旋转 1 分钟。小心取出适当的适配器和适配器体积。
程序：适配器连接
22. 准备适配器连接所需的试剂。
22a.解冻 DNA 连接适配器；连接缓冲液，5x；和室温下的连接溶液。
22b.轻弹试管混合，然后短暂离心。
注意：DNA 连接酶应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。
23. 在冰上，按照表 10中所述准备接头连接反应。短暂离心，加入所有试剂后，上下吹打至少 10 至 12 次（不要涡旋）混合，再次短暂离心。
重要提示：每个连接反应只能使用一个单标签接头。每个样品都有不同的 IL-N7## 适配器。如果使用 12-index 适配器，一次打开一个适配器管并避免交叉污染。 QIAseq 96-Unique Dual Index 适配器布局在图3，在使用多道移液器吸取适量的适配器之前，先使用多道移液器刺穿箔片。
对于在板中提供的 QIAseq 96-index I 接头 (CDI)（布局在图 6), 使用多道移液器吸取适量的接头。
重要提示：移液器缓慢混合。反应混合物非常粘稠。不要涡旋。
注意：如果设置多个反应，则准备的主混合物体积比反应总数所需的量大 20%。表 10. 接头连接反应的制备
零件 1 个反应（微升） 末端修复和加成反应（已在试管中） 50µl 连接缓冲液，5x 20µl IL-N7## 或 IL-7##NJ 或 UDIN-96#A 适配器* 2.5 µl 连接溶液† 15 µl DNA连接酶 10µl 无核酸酶水 2.5µl 全部的 100µl *此 IL-N7## 组件适用于 QIAseq 12-Index I 或具有 QIAseq 96-Index I Set A、B、C 或 D 组的 IL-7##NJ 接头的最多 12 个样本索引的接头（ CDI)，以及用于 QIAseq 96-Unique Dual Index Set A 或 B 的 UDIN-96#A。
†连接溶液非常粘稠。它应单独添加到每个反应中，而不是与其他组分预先混合以形成主混合物。不要用连接溶液涂在移液器吸头的外部，否则可能会添加过多的体积。
图 3. 可刺穿的 QIAseq 96-Unique Dual Index Set Adapter Plate 布局。 QIAseq 96-Unique Dual Index Set A (96) 布局 (NQDIB001-NQDIB096) 和 QIAseq 96-Unique Dual Index Set B (96) 布局 (NQDIB097-NQDIB192)。△点击放大图片
QIAseq 96-Index I Set A 或 C 中的 IL-N701NJ 转接板1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N701 N702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715 B N701 N702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715 C N701 N702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715 D N701 N702 N703 N704 N705 N706 N707 N710 N711 N712 N714 N715 E F G H
QIAseq 96-Index I Set B 或 D 中的 IL-N716NJ 转接板1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729 B N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729 C N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729 D N716 N718 N719 N720 N721 N722 N723 N724 N726 N727 N728 N729 E F G H
图 4. QIAseq 96-Index I Set A、B、C 或 D 中样品适配器 (IL-7##NJ) 的布局。每个板的 A 到 D 行都有适配器。 E 到 H 行是空的。每行中的每个孔包含一个样品接头，每个孔中的接头数量足以容纳八个样品。连接中使用的 A、B、C 或 D 组的 IL-N7 Adapter Plate 必须分别与通用 PCR 步骤中的 A、B、C 或 D 组的 IL-S5 标签引物板配对。
24. 在热循环仪中孵育反应，盖子打开，根据表 11。
25. 重要提示：请勿使用加热盖。表 11. DNA 连接的孵育条件
步 温度 时间 1 4°C 1分钟 2 20°C 15 分钟 3 4°C 抓住
26. 完成后，将反应置于冰上并继续“方案：适配器连接 DNA 的清理”。或者，样品可以在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中保存长达 3 天。 -
纯化接头连接的 DNA
开始前的要点
· 来自“方案：接头连接”的整个 100 µl 接头连接的 DNA 是纯化接头连接的 DNA 的起始材料。
· 使用前将 QIAseq Beads 平衡至室温 (15–25°C) 20–30 分钟。
· 彻底涡旋 QIAseq Beads，以确保它们充分重悬；溶液应该是均匀的棕色。如果协议出现延迟，只需涡旋磁珠即可。
· 重要提示：每天准备新鲜的 80% 乙醇。
程序：纯化接头连接的 DNA
27. 将 100 µl 接头连接产物转移到 1.5 ml DNALoBind 管或 300 µl 96 孔 PCR 板中。
28. 添加 80 µl QIAseq 珠子。通过上下吹打 10 次或涡旋充分混合。
29. 在室温下孵育 5 分钟。
30. 将管/板放在磁架上 10 分钟（对于 1.5 ml LoBind 管）或约 15 分钟（对于 300 µl 板），以将珠子与上清液分离。溶液清除后，磁珠仍在磁架上，小心取出并丢弃上清液。
重要提示：不要丢弃珠子，因为它们含有感兴趣的 DNA。
31. 磁珠仍在磁力架上，完全去除残留的上清液。
32. 磁珠仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。小心取出并丢弃洗涤液。
33. 重复乙醇洗涤。
重要提示：在第二次洗涤后彻底清除所有乙醇洗涤痕迹。短暂离心并将管或板放回磁性支架。先用 200 µl 移液器除去乙醇，然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。
34. 磁珠仍在磁架上，在室温下风干 10 分钟。
注意：目视检查颗粒是否完全干燥，并且所有残留的乙醇都已蒸发。
35. 从磁力架上取下试管，加入 52 µl Nuclease-free Water 从磁珠上洗脱 DNA。通过移液充分混合。
36. 将管/板放回磁架，直到溶液清除。
37. 转移 50 µl 上清液至清洁管/板。
38. 在 50 µl 上清液中加入 35 µl QIAseq Beads。通过上下吹打 10 次或涡旋充分混合。
39. 在室温下孵育 5 分钟。
40. 将管/板放在磁架上 5 分钟（用于管）或 10 分钟（用于板）以将珠子与上清液分离。溶液清除后，磁珠仍在磁架上，小心取出并丢弃上清液。
重要提示：不要丢弃珠子，因为它们含有感兴趣的 DNA。
41. 磁珠仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。小心取出并丢弃洗涤液。
42. 重复乙醇洗涤。
重要提示：在第二次洗涤后彻底清除所有乙醇洗涤痕迹。短暂离心并将管或板放回磁性支架。先用 200 µl 移液器除去乙醇，然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。
43. 磁珠仍在磁架上，在室温下风干 10 分钟。
注意：目视检查颗粒是否完全干燥，并且所有残留的乙醇都已蒸发。乙醇残留到目标富集 PCR 步骤将影响 PCR 效率。
44. 从磁力架上取下磁珠，加入 cDNA 从磁珠中洗脱12.4 µl 无核酸酶水。通过移液充分混合。
45. 将管/板放回磁架，直到溶液清除。
46. 将 10.4 µl 上清液转移到清洁的 PCR 管或板中。
47. 与一起处理 ”方案：目标浓缩”。或者，样本可以存储在–30 至 –15°C 在恒温冰箱中最多保存 3 天。 -
目标浓缩
开始前的要点
· 整个 10.4 µl 产品来自“实验方案：纯化接头连接的 DNA“, 是该方案的起始材料。
· 在冰上建立反应。
· 不要涡旋任何试剂或反应。
程序：目标浓缩
48. 准备目标富集所需的试剂。
48a.解冻 QIAseq RNA 缓冲液，5x； QIAseq TCR 面板；和 IL-Forward Primer 在室温下。
48b.轻弹试管混合，然后短暂离心。
注意：HotStarTaq DNA 聚合酶应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。
49. 准备目标富集反应，如中所述表 12，在冰上。短暂离心，上下吹打 7 至 8 次轻轻混匀，然后再次短暂离心。表 12. 目标富集反应的制备
零件 1 反应 接头连接的 DNA（来自“实验方案：纯化接头连接的 DNA”) 10.4 µl QIAseq RNA 缓冲液，5x 4 µl QIAseq TCR 面板 4 µl IL-正向引物 0.8 µl HotStarTaq DNA 聚合酶 0.8 µl 全部的 20 µl
50. 使用表 13中的循环条件对热循环仪进行编程。表 13. 目标富集的循环器设置
步 循环 温度 时间 1 1 95°C 15 分钟 2 8 95°C 15 s 68°C 10 分钟 3 11 72°C 5分钟 4°C 保持
51. 将目标富集反应放入热循环仪并开始运行。
52. 反应完成后，将反应置于冰上并继续“方案： 目标富集的清理”。或者，样品可以在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中保存长达 3 天。 -
目标富集的清理
开始前的要点
· 来自“Procedure: Target Enrichment”的整个 20 µl Target Enriched DNA 反应是纯化目标富集的起始材料。
· 使用前将 QIAseq Beads 平衡至室温 (15–25°C) 20–30 分钟。
· 彻底涡旋 QIAseq Beads，以确保它们充分重悬；溶液应该是均匀的棕色。如果协议出现延迟，只需涡旋磁珠即可。
· 重要提示：每天准备新鲜的 80% 乙醇。
程序：目标富集的清理
53. 将完成的靶向富集反应转移到 1.5 ml DNA LoBind 管或 96 孔 PCR 板中。
54. 添加 80 µl Nuclease-free Water，使每个样品达到 100 µl。
55. 添加 70 µl QIAseq 珠子。通过上下吹打 10 次或涡旋充分混合。
56. 在室温下孵育 5 分钟。
57. 将管/板放在磁架上 5 分钟（用于管）或 10 分钟（用于板）以将珠子与上清液分离。溶液清除后，磁珠仍在磁架上，小心取出并丢弃上清液。
重要提示：不要丢弃珠子，因为它们含有感兴趣的 DNA。
58. 磁珠仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。小心取出并丢弃洗涤液。
59. 重复乙醇洗涤。
60. 重要提示：在第二次洗涤后彻底清除所有乙醇洗涤痕迹。短暂离心并将管或板放回磁性支架。先用 200 µl 移液器除去乙醇，然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。
61. 磁珠仍在磁架上，在室温下风干 10 分钟。
注意：目视检查颗粒是否完全干燥，并且所有残留的乙醇都已蒸发。乙醇残留到下一步将影响 PCR 效率。
62. 从磁力架上取下磁珠，然后加入15.4 µl 无核酸酶水从磁珠上洗脱DNA。通过移液充分混合。
63. 将管/板放回磁架，直到溶液清除。
64. 将 13.4 µl 上清液转移到清洁的 PCR 管或板中。
65. 与一起处理 ”方案：通用 PCR”。或者，样品可以存储在 –30 到–15°C 在恒温冰箱中最多保存 3 天。 -
通用 PCR
开始前的要点
· “方案：目标富集的净化”中的13.4µL产品是本方案的起始材料，具体页数可从QIAGEN官网下载货号为333705的完整说明书进行了解。
· 在冰上建立反应。
· 不要涡旋任何试剂或反应。
· 重要提示：QIAseq 96-Unique Dual Index Set (UDIS-96#K) 标签底漆板必须与匹配的 QIAseq 96-Unique Dual Index Set (UDIN-96#A) 适配器板配对：适配器中使用的 A 或 B连接反应。
· UDIS-96#K 标签引物板 A 或 B 在 96 孔板中包含预分配、干燥的标签引物和通用 PCR 引物。
· 使用标准 200 µl 移液器吸头将组分直接添加到 UDIS-96#K Index Primer 板中，以进行通用 PCR 反应。看图 5用于板中索引引物的布局。
· 重要提示：QIAseq 12-Index I Adapter (IL-S502) 位于单个试管中，必须与 IL-N7## 试管配对。
· 使用前将管在冰上解冻或储存在 4°C。管子完全解冻后，离心管子。
· QIAseq 96-Index I Set A、B、C 或 D (IL-5##SK) 板必须与匹配的 QIAseq 96-Index I Set (IL-7##NJ) 转接板配对：A，适配器连接反应中使用的 B、C 或 D。
· QIAseq 96-Index I Set (IL-5##SK) 板包含预分配、干燥的索引引物和通用 PCR 引物，并密封在需要去除密封的 96 孔板中。
· 将通用 PCR 反应组分直接添加到适当的 IL-5##SK Index Primer 板中。看图 6用于板中索引引物的布局。
程序：通用 PCR
66. 准备通用 PCR 所需的试剂。66a.在室温下解冻 5x 的 QIAseq RNA 缓冲液，并将适当的 IL-S502 管、IL-5##SK 或 UDIS-96#K 板置于室温。
66b.轻弹试管混合，然后短暂离心。
注意：HotStarTaq DNA 聚合酶应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。
67. 根据准备通用 PCR表 14或者表 15，取决于索引集。短暂离心，上下吹打 7 至 8 次混合，然后再次短暂离心。
重要提示：接头连接反应中使用的 A、B、C 或 D 套件的 IL-N7 接头板必须与通用套件中使用的 A、B、C 或 D 套件的匹配 IL-S5 标签引物板配对PCR反应。
重要提示：如果使用 QIAseq 96-index I set A、B、C 或 D，请直接在 IL-S5 Index Primer Plate 中混合 A、B、C 或 D 组中的组分，其中包含预分配、干燥的 IL-S5 index 引物和通用 PCR 引物。看图 6用于在印版中布置索引引物。表 14. 如果使用 QIAseq 12-index I，通用 PCR 反应的设置 (48)
零件 1 反应 纯化样品（来自“程序：目标浓缩”) 13.4 µl QIAseq RNA 缓冲液，5x 4 µl IL-通用底漆 0.8 µl IL-S502 索引底漆 0.8 µl HotStarTaq DNA 聚合酶 1 µl 全部的 20 µl
表 15. 如果使用 QIAseq 96-index I Set A、B、C 或 D* 或 QIAseq 96-Unique，则设置 Universal PCR双索引组 A 或 B†零件 1 反应 纯化样品 13.4 µl QIAseq RNA 缓冲液，5x 4 µl HotStarTaq DNA 聚合酶 1 µl 无核酸酶水 1.6 µl 全部的 20 µl *适用于 A、B、C 或 D 组中的 QIAseq IL-S5##SK 标签引物板。最终的文库双样本索引由 IL-N7##NJ Adapter Plate 和 QIAseq IL-S5##SK Index Primer Plate 的组合确定。如果同时使用 QIAseq 96 索引 A、B、C 和 D 集，则总样本索引级别可高达 384 重。
†适用于 A 或 B 组中的 QIAseq UDIS-96#K Index Primer Plate。最终的文库双样本索引由独特的 UDIN-96#A Adapter Plate 和 QIAseq UDIS-96#K Index Primer Plate 确定。如果同时使用 QIAseq 96-Unique Dual Index Sets A 和 B，总样本索引级别可高达 192-plex。
图 5. 可刺穿的 QIAseq 96-Unique Dual Index Set Adapter Plate 布局。 QIAseq 96-Unique Dual Index Set A (96) 布局 (SQDIB001- SQDIB096) 和 QIAseq 96-Unique Dual Index Set B (96) 布局 (SQDIB097- SQDIB192)。△点击放大图片
QIAseq 96-index I Set A 或 B 中的 IL-S502SK Index Primer Plate1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A S502 S502 S502 S502 S502 S502 S502 S502 S502 S502 S502 S502 B S503 S503 S503 S503 S503 S503 S503 S503 S503 S503 S503 S503 C S505 S505 S505 S505 S505 S505 S505 S505 S505 S505 S505 S505 D S506 S506 S506 S506 S506 S506 S506 S506 S506 S506 S506 S506 E S507 S507 S507 S507 S507 S507 S507 S507 S507 S507 S507 S507 F S508 S508 S508 S508 S508 S508 S508 S508 S508 S508 S508 S508 G S510 S510 S510 S510 S510 S510 S510 S510 S510 S510 S510 S510 H S511 S511 S511 S511 S511 S511 S511 S511 S511 S511 S511 S511
QIAseq 96-index I Set C 或 D 中的 IL-S513SK Index Primer Plate1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A S513 S513 S513 S513 S513 S513 S513 S513 S513 S513 S513 S513 B S515 S515 S515 S515 S515 S515 S515 S515 S515 S515 S515 S515 C S516 S516 S516 S516 S516 S516 S516 S516 S516 S516 S516 S516 D S517 S517 S517 S517 S517 S517 S517 S517 S517 S517 S517 S517 E S518 S518 S518 S518 S518 S518 S518 S518 S518 S518 S518 S518 F S520 S520 S520 S520 S520 S520 S520 S520 S520 S520 S520 S520 G S521 S521 S521 S521 S521 S521 S521 S521 S521 S521 S521 S521 H S522 S522 S522 S522 S522 S522 S522 S522 S522 S522 S522 S522
图 6. QIAseq 96-Index I Set A、B、C 或 D 中 IL-S5##SK 标签引物板的布局。每个孔包含一个预分配、干燥的样品标签引物和通用引物对，用于单次反应.在通用 PCR 步骤中，用于连接的 A、B、C 或 D 组中的 IL-N7##NJ 适配器板必须分别与 A、B、C 或 D 组中的 IL-S5##SK 标签引物板配对。
68.使用中的循环条件对热循环仪进行编程表 16表 16. 通用 PCR 的循环条件
步 循环 温度 时间 1 1 95°C 15 分钟 2 25–30* 95°C 15 s 60°C 2 分钟 3 11 72°C 5分钟 4°C 保持 *周期数可以根据样本类型和用户体验进行调整。文库产量与输入量和样品类型有关。对于正常的 PBMC RNA，建议 10-50 ng 使用 30 个循环，50-100 ng 使用 29 个循环，100-500 ng 使用 27 个循环，500-1000 ng 使用 25 个循环。
69. 反应完成后，将反应置于冰上并继续“方案： 通用 PCR 的净化”。或者，样品可以在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中保存长达 3 天。 -
通用 PCR 的净化
开始前的要点
· 来自“Procedure: Universal PCR”的整个 20 µl Universal PCR 反应是 Universal PCR 净化的起始材料。
· 使用前将 QIAseq Beads 平衡至室温 (15–25°C) 20–30 分钟。
· 彻底涡旋 QIAseq Beads，以确保它们充分重悬；溶液应该是均匀的棕色。如果协议出现延迟，只需涡旋磁珠即可。
· 重要提示：每天准备新鲜的 80% 乙醇。
程序：通用 PCR 的净化
70. 将完成的 Universal PCR 反应转移到 1.5 ml DNA LoBind 管或 96 孔 PCR 板中。
71. 添加 80 µl Nuclease-free Water，使每个样品达到 100 µl。
72. 添加 70 µl QIAseq 珠子。通过上下吹打 10 次或涡旋充分混合。
73. 在室温下孵育 5 分钟。
74. 将管/板放在磁架上 5 分钟（用于管）或 10 分钟（用于板）以将珠子与上清液分离。溶液清除后，磁珠仍在磁架上，小心取出并丢弃上清液。
重要提示：不要丢弃珠子，因为它们含有感兴趣的 DNA。
75. 磁珠仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。小心取出并丢弃洗涤液。
76. 重复乙醇洗涤。
重要提示：在第二次洗涤后彻底清除所有乙醇洗涤痕迹。短暂离心并将管或板放回磁性支架。先用 200 µl 移液器除去乙醇，然后用 10 µl 移液器除去任何残留的乙醇。
77. 磁珠仍在磁架上，在室温下风干 10 分钟。
注意：目视检查颗粒是否完全干燥，并且所有残留的乙醇都已蒸发，但注意不要过度干燥磁珠，因为这会显着降低洗脱效率。
78. 从磁力架上取下磁珠，加入 30 µl Nuclease-free Water 从磁珠上洗脱 DNA。通过移液充分混合。
79. 将管/板放回磁架，直到溶液清除。
80. 转移 28 µl 上清液以清洁 PCR 管或板。
81. 继续“附录A：使用QIAseq库定量系统进行库定量”，第54页。或者，在使用QIAseq库定量系统进行定量之前，可以将库存储在-30至-15°C的恒温冷冻柜中长达3个月。完成量化后，继续下一页的“方案：Illumina MiSeq和NextSeq上的测序设置”。
注意：安捷伦生物分析仪可用于使用高灵敏度DNA试剂盒检查片段大小和浓度。有关详细信息，请参阅附录C：文库。附录内容可在QIAGEN官网下载货号为333705的产品完整说明书进行了解。