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6.9 DNA/RNA 同时建库

| 6.10 OGM试剂盒

如下操作步骤以产品货号333955的步骤为例，产品列表详见右下方推荐产品

实验步骤

核酸片段化，标准样品

开始前的要点

· 该操作步骤描述了来自“标准样品”（即细胞或组织）的核酸片段化。 FFPE样本 的碎片化，请参考“操作步骤：核酸碎片，FFPE 样品”.

· 该方案设计用于使用总核酸洗脱液（含有 DNA+RNA 的洗脱液）或单独的 DNA 和 RNA 洗脱液。

· 在执行“方案：在单管中结合靶向 DNA+RNA 富集”时，建议的 DNA 量为 10–40 ng 。

· 在单独的试管中分离靶向 DNA 和 RNA 富集”时，建议的 DNA 量为 20-80 ng 。

· 推荐的 RNA 量为 10 ng 至 250 ng 总 RNA 。在处理总核酸样本时，我们建议根据定量 DNA 的量输入。

· 在冰上建立反应。

· 不要涡旋任何试剂或反应。

程序
1. 在冰上解冻核酸样本。轻轻混合，短暂离心以收集管壁上的残留液体，然后放回冰上。

2. 准备碎片所需的试剂。
2a.在室温 (15–25°C) 下解冻碎片缓冲液、 10x 和 FERA 溶液。
2b.轻弹试管混合，然后短暂离心。
注意： 副反应减少剂和碎裂酶混合物应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

3. 在冰上，根据表7 。短暂离心，上下吹打混合 10-12 次 ，然后再次短暂离心。
注意： 如果设置了多个反应，则准备的预混液体积比反应总数所需的量大 10% 。

表 7. 核酸片段化反应混合物

零件	体积/反应
DNA（参见“要点在开始之前“ 部分）*	变量 A
DNA（参见“要点在开始之前“ 部分）*	变量 B
碎片缓冲液，10x	2µl
FERA 溶液	0.6µl
副反应还原剂	1.6 µl
碎片酶混合物	4µl
无核酸酶水	11.8 µl – 可变 A (DNA) – 可变 B (RNA)
全部的	20µl

*可以添加同时包含 DNA 和 RNA 的总核酸，而不是单独添加 DNA 和 RNA 。如果添加总核酸，则输入量基于 DNA。

4. 根据表 8。使用仪器的加热盖。

表 8. 核酸片段化的孵育条件

步	孵化温度	孵化时间
1	4°C	1分钟
2	32°C	24 分钟
3	72°C	30分钟
4	4°C	抓住

5. 在将管/板添加到热循环仪之前，启动程序。当热循环仪达到 4°C 时，暂停程序。
重要提示： 热循环仪必须预冷并在 4°C 下暂停。

6. 转移步骤中准备的 管/板3 到预冷的热循环仪并恢复程序。

7. 完成后，让热循环仪回到 4°C 。

8. 将样品放在冰上并立即进行“方案： RNA多聚腺苷酸化”.

核酸片段化，FFPE 样品

开始前的要点
· 该操作步骤描述了 FFPE 样品中核酸的片段化。关于“标准样品”（即细胞或组织）的碎片化，请参阅“操作步骤：核酸片段化，标准样品”。

· 该方案设计用于使用总核酸洗脱液（含有 DNA+RNA 的洗脱液）或单独的 DNA 和 RNA 洗脱液。

· 如果使用了 QIAseq QuantiMIZE 试剂盒，建议的 FFPE DNA 量最高为 250 ng DNA如果使用替代方法来确定 FFPE DNA 的浓度，则最多可以使用 100 ng DNA。建议的 FFPE RNA 量为 250 ng 总 RNA（对于“严重”片段化的 FFPE 样品最高为 500 ng，“严重”被定义为具有少于 40% 片段的样品 >200 nt 在生物分析仪上进行涂片分析） .在处理总核酸样本时，我们建议根据定量 DNA 的量输入。

· 在冰上建立反应。

· 不要涡旋任何试剂或反应。

程序
1. 在冰上解冻核酸样本。轻轻混合，短暂离心以收集管壁上的残留液体，然后放回冰上。

2. 准备碎片所需的试剂。
2a.在室温下解冻碎片缓冲液、10x 和 FERA 溶液。

2b.轻弹试管进行混合，然后短暂离心。
注意：副反应还原剂和碎裂酶混合物应从在使用前将冰箱放在冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

3. 在冰上，根据表 9。短暂离心，上下吹打混合 10-12 次，然后再次短暂离心。
注意：如果设置了多个反应，请准备体积大于 10% 的预混液比反应总数所需的数量。

表 9. 核酸片段化反应混合物

零件	体积/反应
DNA（参见“要点在开始之前“ 部分）*	变量 A
RNA（参见“要点在开始之前“ 部分）*	变量 B
碎片缓冲液，10x	2µl
FERA 溶液	0.6µl
副反应还原剂	1.6µl
无核酸酶水	11.8 µl – 可变 A (DNA) – 可变 B (RNA)
全部的	16µl

*可以添加同时包含 DNA 和 RNA 的总核酸，而不是单独添加 DNA 和 RNA。如果添加总核酸，则输入量基于 DNA。

4. 在 37°C 下孵育 15 分钟，然后置于冰上。

5. 在每个反应中加入 4 µl Fragmentation Enzyme Mix。短暂离心，上下吹打混合 10-12 次（不要涡旋），然后再次短暂离心。
重要提示：在整个反应设置过程中，将反应管/反应板置于冰上。

6.根据表 10。使用仪器的加热盖。

表 10. 核酸片段化的孵育条件

步	孵化温度	孵化时间
1	4°C	1分钟
2	32°C	14 分钟
3	72°C	30分钟
4	4°C	抓住

7. 在将管/板添加到热循环仪之前，启动程序。当热循环仪达到 4°C 时，暂停程序。
重要提示：热循环仪必须预冷并在 4°C 下暂停。

8. 将步骤 5 中准备的管/板转移到预冷的热循环仪并恢复程序。

9. 完成后，让热循环仪回到 4°C。

10. 将样品置于冰上，立即进行“方案：RNA 多聚腺苷酸化”.

RNA 多聚腺苷酸化

开始前的要点
· 产品来自“操作步骤：核酸片段化，标准样品”, 或者 ”方案：核酸片段化，FFPE 样品”，是该操作步骤的起始材料。

· 在冰上建立反应。

· 不要涡旋任何试剂或反应。

程序
1. 准备聚腺苷酸化所需的试剂。
1a.在室温下解冻 PAP 稀释缓冲液、10x 和 ATP 溶液。

1b.轻弹试管混合，然后短暂离心。
注意：T4 多核苷酸激酶和 PAP 酶应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

2. 用 18 µl 无核酸酶水稀释 2 µl 10x PAP 稀释缓冲液，制备 1x PAP 稀释缓冲液。

3. 使用 1x PAP 稀释缓冲液将等分的 PAP 酶从 5 U/µl 稀释至2 U/微升。短暂离心，上下吹打混合 10-12 次，然后再次短暂离心。

4. 根据准备 RNA 多腺苷酸化混合物表 11。短暂离心，上下吹打混合 10-12 次，然后再次短暂离心。
注意：如果设置了多个反应，则准备的预混液体积比反应总数所需的量大 10%。

表 11. RNA 多聚腺苷酸化反应混合物

零件	体积/反应
裂解反应（已在试管中）	20µl
ATP 溶液	1.25µl
T4 多核苷酸激酶	1µl
稀释的 PAP 酶 (2 U/µl)*	1 µl
无核酸酶水	1.75µl
全部的	25µl

*确保使用 1x PAP 稀释缓冲液将 PAP 酶从其原液 5U/µl 浓度稀释到 2U/µl。

5. 根据以下步骤在热循环仪中孵育反应表 12。使用仪器的加热盖。

表 12. RNA 多聚腺苷酸化的孵育条件

步	孵化温度	孵化时间
1	4°C	1分钟
2	30°C	10 分钟
3	4°C	抓住

6. 完成后，将反应置于冰上并继续“方案：DNA 连接”.

DNA 连接

开始前的要点
· “方案：RNA 多聚腺苷酸化“, 是该操作步骤的起始材料。

· 在冰上建立反应。

· 不要涡旋任何试剂或反应。

· QIAseq Beads 用于所有反应净化。

· 重要提示：每天准备新鲜的 80% 乙醇。

· 确保 QIAseq Beads 始终完全混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需涡旋磁珠即可。

程序
1. 准备 DNA 连接所需的试剂。
1a.解冻 DNA 连接适配器；连接缓冲液，5x；和室温下的连接溶液。
1b.轻弹试管混合，然后短暂离心。
注意：DNA 连接酶应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

2. 根据制备 DNA 结扎混合物表 13。短暂离心，上下吹打混合 10-12 次，然后再次短暂离心。
重要提示：移液器缓慢混合。反应混合物非常粘稠。不要涡旋。
注意：如果设置了多个反应，则准备的预混液体积比反应总数所需的量大 10%。

表 13. DNA 连接反应混合物

零件	体积/反应
RNA 多聚腺苷酸化反应（已在试管中）	25µl
连接缓冲液，5x	10µl
DNA 连接接头	2.8 µl
DNA 连接酶	5µl
连接溶液*	7.2µl
全部的	50µl

*连接溶液非常粘稠。它应该单独添加到每个反应中，而不是与其他组分预混合作为主混合物。不要用连接溶液涂抹移液器吸头的外部，因为这样做可能会增加多余的体积。

3. 根据以下步骤在热循环仪中孵育反应表 14。
重要提示：请勿使用加热的盖子。

表 14. DNA 连接的孵育条件

步	孵化温度	孵化时间
1	4°C	1分钟
2	20°C	15 分钟
3	4°C	抓住

4. 加入 50 µl 无核酸酶水，使每个样品达到 100 µl。

5. 加入 130 µl QIAseq Beads，然后涡旋混合。

6. 在室温下孵育 5 分钟。

7. 将管/板放在磁架上 2 分钟（用于管）或 10 分钟（用于板）。

8. 溶液澄清后，磁珠仍在磁架上，小心取出并丢弃上清液。
重要提示：不要丢弃磁珠，因为它们含有感兴趣的 DNA。

9. 加入 80 µl Nuclease-free Water 重悬磁珠，然后加入 128 µl QIAseq NGS Bead Binding Buffer。通过涡旋混合并在室温下孵育 5 分钟。

10. 将管/板放在磁架上 2 分钟（用于管）或 10 分钟（用于板）。溶液清除后，磁珠仍在磁架上，小心取出并丢弃上清液。

11. 磁珠仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管子 2-3 次或在磁铁的 2 个柱位置之间左右移动板以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。

12. 重复乙醇洗涤。
重要提示：在第二次洗涤后彻底清除所有乙醇痕迹。首先用 200 µl 移液器吸头去除乙醇，短暂旋转，然后使用 10 µl 移液器吸头去除任何残留的乙醇。

13. 磁珠仍在磁力架上，在室温下风干 5-10 分钟。
注意：目视检查颗粒以确认其完全干燥。如果颗粒没有完全干燥，可能需要额外的干燥时间。

14. 从磁力架上取下磁珠，然后加入 19 µl Nuclease-free Water 从磁珠上洗脱 DNA。通过移液充分混合。

15. 将管/板放回磁架，直到溶液清除。

16. 将 16.62 µl 上清液转移到清洁管/板上。
继续 ”操作步骤：逆转录”. 或者，样品可以在 -30 至 -15°C 的恒温冰箱中储存。

逆转录

开始前的要点
· 16.62 µl 产品来自“方案：DNA 连接”, 是该操作步骤的起始材料。

· 在冰上建立反应。

· 不要涡旋任何试剂或反应。

· QIAseq Beads 用于所有反应净化。

· 重要提示：每天准备新鲜的 80% 乙醇。

· 确保 QIAseq Beads 始终完全混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需涡旋磁珠即可。

程序
1. 准备逆转录所需的试剂。
1a.解冻 Multimodal RT Primer；多模式 RT 缓冲液，5x；和 Multimodal RT Enhancer 在室温下。
1b.轻弹试管混合，然后短暂离心。
注意：RNase Inhibitor 和 EZ Reverse Transcriptase 应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

2. 根据准备逆转录组合表 15。短暂离心，上下吹打混合 10-12 次，然后再次短暂离心。
注意：如果设置了多个反应，请准备体积大于 10% 的预混液比反应总数所需的数量。

表 15. 逆转录反应混合物

零件	体积/反应
样品（来自“方案：DNA 连接”)	16.62 µl
多模式 RT 引物	1µl
多模式 RT 缓冲液，5x	5 µl
多模式 RT 增强剂	0.5µl
RNase 抑制剂	0.63µl
EZ 逆转录酶	1.25µl
全部的	25µl

3. 根据以下步骤在热循环仪中孵育反应表 16。使用仪器的加热盖。

表 16. 逆转录的孵育条件

步	孵化温度	孵化时间
1	4°C	1分钟
2	25°C	10 分钟
3	42°C	45 分钟
4	70°C	15 分钟
5	4°C	抓住

4. 添加 75 µl 无核酸酶水，使每个样品达到 100 µl。

5. 加入 130 µl QIAseq Beads 并通过涡旋或上下吹打数次混合。

6. 在室温下孵育 5 分钟。

7. 将管/板放在磁架上 2 分钟（用于管）或 10 分钟（用于板）。

8. 溶液澄清后，磁珠仍在磁架上，小心取出并丢弃上清液。
重要提示：不要丢弃磁珠，因为它们含有感兴趣的 DNA。

9. 磁珠仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管子 2-3 次或在磁铁的 2 个柱位置之间左右移动板以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。

10. 重复乙醇洗涤。
重要提示：第二次洗涤后，彻底清除所有乙醇痕迹。首先用 200 µl 移液器吸头除去乙醇，短暂旋转，然后使用 10 µl 移液器吸头除去任何残留的乙醇。

11. 磁珠仍在磁力架上，在室温下风干 5-10 分钟。
注意：目视检查颗粒以确认其完全干燥。如果颗粒没有完全干燥，可能需要额外的干燥时间。乙醇残留到下一个通用 PCR 步骤将影响 PCR 效率。

12.从磁力架上取下磁珠，然后加入 15 µl Nuclease-free Water 从磁珠上洗脱 DNA。
重要提示：如果执行分离的 DNA 和 RNA 靶标富集（附录 B)，加入 22.4 µl Nuclease-free Water 洗脱。

13. 将管/板放回磁架，直到溶液清除。

14. 将 12.4 µl 上清液转移到干净的试管/板上。
重要提示：如果进行分离的 DNA 和 RNA 靶标富集（附录 B），将 10.2 µl 洗脱液转移到 2 个试管中的每个试管中，然后继续执行附录 B 操作步骤。

15. 继续 “方案：在单个试管中结合靶向 DNA+RNA 富集”. 或者，样品可以在 –30 至 –15°C 的温度下储存在恒温冰箱中。

在单个试管中结合靶向 DNA+RNA 富集

开始前的要点
· 12.4 µl 产品来自“操作步骤：逆转录”, 是该操作步骤的起始材料。

· 在冰上建立反应。

· 不要涡旋任何试剂或反应。

· 最终的文库双样本索引由 QIAseq Multimodal N7 Plate 和 QIAseq Multimodal S5 Plate 组合确定。 QIAseq Beads 用于所有反应净化。

重要提示：要使用此操作步骤，需要满足以下条件之一：
· QIAseq Multimodal Index I (12)（货号 333962）
· QIAseq Multimodal Index I Set A (96)（货号 333965）

· QIAseq Multimodal Index I Set B (96)（货号 333975）

这些板有 12 或 48 反应形式，允许对 12 个 DNA 和 RNA 样品或 48 个 DNA 和 RNA 样品进行索引（使用一组 A 或 B 组的一个板）。在可切割板的每个指示孔中，都有用于 DNA 和 RNA 的干燥 N7 索引引物。板可以按列切割，以便对所需数量的样品进行索引。
每个索引试剂盒包括两个 A 组或 B 组板，用于制作总共 96 个 DNA 和 96 个 RNA 文库。通过组合 A 组和 B 组，可以复用多达 96 个 DNA 和 96 个 RNA 文库。板中的每个孔都是一次性使用。

· 重要提示：测序样品设置表中描述了所需的索引组合：
· 样品表多式联运 UDI 集 A：www.qiagen.com/PROM-15281
· 样品表多式联运 UDI 集 B：www.qiagen.com/PROM-15282
· 样品表多式联运 UDI 集 A 和集 B：www.qiagen.com/PROM-15283

· 重要提示：每天准备新鲜的 80% 乙醇。

· 确保 QIAseq Beads 始终完全混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需涡旋磁珠即可。

程序
1. 准备目标富集所需的试剂。
1a.解冻 TEPCR 缓冲液，5x；多式联运 DHS 小组 (DNA)；和多模式 VHS 面板 (RNA)；并将 QIAseq Multimodal N7 Plate 置于室温。
1b.轻弹试管混合，然后短暂离心。
注意：QIAseq Multimodal N7 Plate 只需离心，无需混合。HotStarTaq DNA 聚合酶应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

2. 根据准备目标富集组合表 17。短暂离心，上下吹打混合 10-12 次，然后再次短暂离心。
注意：如果设置了多个反应，则准备的预混液体积比反应总数所需的量大 10%。

表 17. 目标富集的反应混合物

零件	体积/反应
样品（来自“操作步骤：逆转录“)	12.4µl
TEPCR 缓冲液，5x	8µl
多模态国土安全部组合（DNA）	10µl
多模态 VHS 面板（RNA）	8µl
HotStarTaq DNA 聚合酶（6 U/μl）	1.6µl
全部的	40µl

3. 将 40 µl 目标富集反应混合物添加到 QIAseq Multimodal N7 板的孔中（表 18，表 19，和表 20)，它们是可切割的板，在同一孔中包含用于 DNA 和 RNA 样品的预分配、干燥的索引引物对。
注意：板可以按列切割，以便对所需数量的样品进行索引。

表 18. QIAseq Multimodal N7 板的布局，12 个反应

DNAp-M001

RNAp-M049

DNAp-M009

RNAp-M057

Empty

DNAp-M002

RNAp-M050

DNAp-MOW

S10

RNAp-M058

Empty

DNAp-M003

RNAp-MO51

DNAp-MO11

S11

RNAp-M059

Empty

DNAp-M004

RNAp-M052

DNAp-M012

S12

RNAp-MOGO

Empty

DNAp-M005

RNAp-M053

Empty

Emply

Empty

DNAp-MQ06

RNAp-M054

Empty

DNAp-M007

RNAD-M055

Empty

Empt/

Empty

DNAp-M008

RNAp-M056

Empty

表 19. QIAseq Multimodal N7 板的布局，48 次反应 Set A

DNAp-MOOl

RNAp-M049

DHAP-M009

RNAp-M057

DNAp-M017

S17

RNAp-MD65

DNAp-M025

S25

RNAp-MO73

DNAp-M033

S33

RNAp-MO81

DNAp-M041

S41

RNAp-MOBS

Empty

DNAp-M002

RNAp M050

DNAp-M010

S10

RNAp M058

DNAp-M018

S18

RNAp M066

DNAp-MO26

S26

RNAp M074

RNAp-MO34

S34

RNAp M082

ONAp-M042

S42

RNAp M090

Empty

DNAp-M003

RNAp-M051

DNAp-MO11

S11

RNAp-M059

DNAp-MD19

S19

RNAp-M067

DNAp-MO27

S27

RNAp-M75

DNAp-M035

S35

RNAp-M083

DNAp-M043

S43

RNAp-M091

Empty

DNAp-MOQ4

RNAp-M052

DNAp-MO12

S12

RNAp-M060

DNAp-MD20

S20

RNAp-M068

DNAP-M02S

S28

RNAp-M076

DNAp-M036

RNAp-M084

DNAp-M044

S44

RNAp-M092

Empty

DNAp-M005

RNAp - M053

DNAp-M013

S13

RNAP-M061

DNAp-MD21

S21

RNAp-M069

DNAp-MO2S

S29

RNAp-MO77

DNAp-MO37

S37

RNAp-M085

DNAp-MO45

S45

RNAp-M093

Empty

DNAp-MOOG

RNAp-M054

DNAp-MO14

S14

RNAp-M062

DNAp-M022

S22

RNAp-M070

DNAp-M030

S30

RNAp-M076

DNAp-M038

S38

RNAp - M086

DNAp-M046

S46

RNAp-M094

Empty

DNAp M007

RNAp-M055

DNAp M015

S15

RNAp-M063

DNAp M023

S23

RNAp-M071

DNAp M031

S31

RNAp-M07S

DNAp MO3g

S39

RNAp-M087

DNAp M047

S47

RNAp-MQ95

Empty

DNAp-MOOB

RNAp-M056

DNAp-M016

S16

RNAp-MD64

DNAp-M024

S24

RNAp-MD72

DNAp-M032

S32

RNAp-MO8fl

DNAp-M04C

S40

RNAp-M08S

DNAp-M048

S48

RNAp-M096

Empty

表 20. QIAseq Multimodal N7 板的布局，48 次反应 Set B

DNAp-M097

S49

RNAp-M145

DNAp-M105

S57

RNAp-M153

DNAp-M113

S65

RNAp-M161

DNAp-M121

S73

RNAp-M169

DNAp-M129

S81

RNAp-M177

DNAp-M137

S89

RNAp-M185

Empty

DNAp-M098

S50

RNAp-M146

DNAp-M106

S58

RNAp-M154

DNAp-M114

S66

RNAp-M162

DNAp-M122

S74

RNAp-M170

DNAp-M130

S82

RNAp-M178

DNAp-M138

S90

RNAp-M186

Empty

DNAp-M099

S51

RNAp-Ml47

DNAp-M107

S59

RNAP-M155

DNAp-M115

S67

RNAp-M163

DNAp-M123

S75

RNAp-M171

DNAp-M131

S83

RNAp-M179

DNAp-M139

S91

RNAp-M187

Empty

DNAp M100

S52

RNAp-M148

DNAp-M108

S60

RNAp-M156

DNAp M116

S88

RNAp-M164

DNAp-M124

S76

RNAp-M172

DNAp M132

S84

RNAp-M180

DNAp M14Q

S92

RNAp-M18fl

Empty

DNAp-M101 S53 RNAp-M149

DNAp-M109 S61 RNAp-M157

DNAp-M117

S69

RNAp-M165

DNAp-M125 S77

RNAp-M173

DNAp-M133 S85 RNAp-M181

DNAp-M141

S93

RNAp-M189

Empty

DNAp-M102

S54

RNAp-Ml50

DNAp-M110

S62

RNAp-M153

DNAp-M118

S70

RNAp-M166

DNAp-M126

S78

RNAp-M174

DNAp-M134

S86

RNAp-M182

DNAp-M142

S94

RNAp-M190

Empty

Em pa

Empty

DNAp-M103

S55

RNAp-M151

DNAp-M111

S63

RNAp-M159

DNAp-M119

S71

RNAp-M167

DNAp-M127

S79

RNAp-M175

DNAp-M135

S37

RNAp-M133

DNAp-M143

S95

RNAp-M191

Empty

DNAp-M104

S56

RNAp-M152

DNAp-M112

S64

RNAp-M160

DNAp-M120

S72

RNAp-M168

DNAp-M128

S80

RNAp-M176

DNAp-M136

S88

RNAp-M184

DNAp-M144

S96

RNAp-M192

Empty

4. 短暂离心，上下吹打混合 8 次，然后再次短暂离心。
注意：如果只使用一个柱子，从可切割板上切下该柱子，然后继续下一步。

5. 使用中的循环条件对热循环仪进行编程表 21(DNA+RNA 引物<1500) 或表 22（DNA+RNA 引物≥1500）。

表 21. 如果 DNA+RNA 引物 <1500，靶标富集的循环条件

步	时间	温度
初始变性	13 分钟	95°C
初始变性	2 分钟	98°C
8个周期	15 秒	98°C
8个周期	10 分钟	68°C
抓住	5分钟	72°C
抓住	∞	4°C

表 22. 引物数≥1500/管时靶标富集的循环条件

步	时间（1500–12,000 引物/管）	时间（>12,000 引物/管）	温度
初始变性	13 分钟	13 分钟	95°C
	2 分钟	2 分钟	98°C
6个周期	15 s	15 s	98°C
	15 分钟	30分钟	65°C
1个周期	5分钟	5分钟	72°C
抓住	5分钟	5分钟	4°C
抓住	∞	∞	4°C

6. 将目标富集反应放入热循环仪并开始运行。

7. 运行完成后，添加 60 µl 无核酸酶水，使每个样品达到 100 µl。

8. 加入 100 µl QIAseq Beads 并通过涡旋或上下吹打数次混合。

9. 在室温下孵育 5 分钟。

10. 将管/板放在磁架上 2 分钟（用于管）或 10 分钟（用于板）。

11. 溶液澄清后，磁珠仍在磁架上，小心取出并丢弃上清液。
重要提示：不要丢弃磁珠，因为它们含有感兴趣的 DNA。
重要提示：当 DNA+RNA 引物≥12000 时，加入 75 µl Nuclease-free Water 重悬磁珠，然后加入 75 µl QIAseq Bead Binding Buffer。通过上下涡旋或移液混合。重复步骤 9 到 11。

12. 磁珠仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管子 2-3 次或在磁铁的 2 个柱位置之间左右移动板以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。

13. 重复乙醇洗涤。
重要提示：第二次洗涤后，彻底清除所有乙醇痕迹。首先用 200 µl 移液器吸头除去乙醇，短暂旋转，然后使用 10 µl 移液器吸头除去任何残留的乙醇。

14. 磁珠仍在磁力架上，在室温下风干 5-10 分钟或更长时间。
注意：目视检查颗粒以确认其完全干燥。乙醇残留到下一个通用 PCR 步骤将影响 PCR 效率。

15. 从磁力架上取下磁珠，然后加入 25 µl Nuclease-free Water 从磁珠上洗脱 DNA。通过移液充分混合。

16. 将管/板放回磁架，直到溶液清除。

17. 将 24 µl 上清液转移到干净的试管/板上。这将在接下来的 2 个操作步骤中使用。

18. 继续 ”方案：通用 PCR 循环的 qPCR 测定“. 或者，可以将样品储存在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中。

通用 PCR 循环的 qPCR 测定

开始前的要点
· 两微升产品来自“方案：结合靶向 DNA+RNA 单管富集“，或者 ”附录 B：分离的靶向 DNA 和单独管中的 RNA 富集“，是每种反应混合物的起始材料。

· 重要提示：此过程需要 EvaGreen，20x 水溶液，并且必须从 Biotium 购买（货号 31000-T，31000）

· 在冰上建立反应。

· 不要涡旋任何试剂或反应。

程序
1. 准备 qPCR 所需的试剂。
1a.解冻 UPCR 缓冲液，5x； DNA qPCR AMP 组；和 RNA qPCR AMP。设置在室温。
1b.轻弹试管混合，然后短暂离心。
注意：HotStarTaq DNA 聚合酶应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

2. 根据准备 qPCR 反应表 23用于 DNA 文库或表 24用于 RNA 文库。短暂离心，上下吹打混合 10-12 次，然后再次短暂离心。
注意：如果设置了多个反应，请准备体积大于 10% 的预混液比反应总数所需的数量。

表 23. DNA 文库 qPCR 的反应混合物

零件	体积/反应
样品（来自“方案：结合靶向 DNA+RNA 富集单管“)	2 µl
或者
DNA 样本（来自“附录 B：分离的靶向 DNA 和 RNA在单独的管中富集“)
UPCR 缓冲液，5x	2 µl
无核酸酶水	4.1 µl
DNA qPCR AMP 套件	1µl
HotStarTaq DNA 聚合酶 (6 U/µl)	0.4µl
EvaGreen，20x 水溶液*	0.5µl
全部的	10µl

*必须从 Biotium 购买（货号 31000-T、31000）。

表 24. RNA 文库 qPCR 的反应混合物

零件	体积/反应
样品（来自“方案：结合靶向 DNA+RNA 富集单管“，页43)	2 µl
或者
RNA 样本（来自“附录 B：分离的靶向 DNA 和 RNA在单独的管中富集“，页74)
UPCR 缓冲液，5x	2 µl
无核酸酶水	4.1 µl
RNA qPCR AMP 套装	1µl
HotStarTaq DNA 聚合酶 (6 U/µl)	0.4µl
EvaGreen，20x 水溶液*	0.5µl
全部的	10µl

*必须从 Biotium 购买（货号 31000-T、31000）。

3. 使用中的循环条件对 qPCR 仪器进行编程表 25。
注意：不需要熔解曲线。

表 25. RNA 文库 qPCR 的反应混合物

步	时间	温度
抓住	13 分钟	95°C
抓住	2 分钟	98°C
2 步循环
变性	15 s	98°C
退火/延伸*	2 分钟	62°C
周期数	30 个周期
抓住	∞	4°C

*执行荧光数据收集。

4. 反应后，确定 C_T 值。基于 C_T 值，通用 PCR 循环数定义为 C_T^（qPCR）+3，用于 DNA 和 RNA 文库。
例如，如果 DNA qPCR 为 C_T=19，则为 DNA 通用 PCR 执行 22 个循环。如果 RNA qPCR 为 C_T=15，则为 RNA 通用 PCR 执行 18 个循环。
替代方法：
运行完成后，观察“日志视图”中的扩增图并使用“自动基线”定义基线。使用扩增图的“对数视图”，确定扩增曲线达到其平台期的循环，并减少使用 2 个循环。例如，如果在 C_T为 18 时达到平台期，则 16 是所需的通用 PCR 扩增循环数。

5. 一旦确定了通用 PCR 的扩增循环，继续“操作步骤：通用 PCR”,

通用 PCR

开始前的要点
· 九微升产品来自“方案：结合靶向 DNA+RNA 富集单管“，或者 ”附录 B：分离的靶向 DNA 和 RNA 富集分离管“，是每种反应混合物的起始材料。

· 扩增所需的循环数在“操作步骤：qPCR 通用 PCR 循环的测定”,

· 在冰上建立反应。

· 不要涡旋任何试剂或反应。

· QIAseq Multimodal S5 Plates 采用 12 或 48 反应形式，可分别对 12 个 DNA 和 RNA 样品或 48 个 DNA 和 RNA 样品进行索引。 QIAseq Multimodal S5 Plates 中的每个孔都是一次性使用的。 SQDIB001 至 SQDIB048 和 SQDIB097 至 SQDIB144 与通用 DNA 引物混合用于 DNA 文库扩增。 SQDIB0049 至 SQDIB096 和 SQDIB0145 至 SQDIB192 与通用 RNA 引物混合用于 RNA 文库扩增。 S5引物预计与N7引物配对使用，SQDIB001与DNApM001配对，SQDIB002与DNAp-M002配对等； SQDIB049 与 RNAp-M049 配对，SQDIB050 与 RNAp-M050 配对等。板可按列切割，以便对所需数量的样品进行索引。

· 最终的文库双样本索引由 QIAseq Multimodal N7 Plate 和 QIAseq Multimodal S5 Plate 组合确定。

· 重要提示：测序样品设置表中描述了所需的索引组合：
·样品表多式联运 UDI 集 A：www.qiagen.com/PROM-15281
·样品表多式联运 UDI 集 B：www.qiagen.com/PROM-15282
·样品表多式联运 UDI 集 A 和集 B：www.qiagen.com/PROM-15283

· QIAseq Beads 用于所有反应净化。

· 重要提示：每天准备新鲜的 80% 乙醇。

· 确保 QIAseq Beads 始终完全混合。这需要快速工作并在使用前立即重新悬浮珠子。如果操作步骤出现延迟，只需涡旋磁珠即可。

程序
1. 准备通用 PCR 所需的试剂。
1a.解冻 UPCR 缓冲液，5x，并将 QIAseq Multimodal S5 Plate 置于室温。
1b.轻弹试管混合，然后短暂离心。

注意：HotStarTaq DNA 聚合酶应在使用前从冰箱中取出并置于冰上。使用后，立即将酶放回冰箱。

2. 根据准备通用 PCR表 26用于 DNA 文库或表 27用于 RNA 文库。短暂离心，上下吹打混合 10-12 次，然后再次短暂离心。
注意：如果设置了多个反应，请准备体积大于 10% 的预混液比反应总数所需的数量。

表 26. DNA 文库组分通用 PCR 的反应混合物

零件	体积/反应
样品（来自“方案：结合靶向 DNA+RNA 富集单管“)	9 µl
或者
DNA 样本（来自“附录 B：分离的靶向 DNA 和 RNA在单独的管中富集“)
UPCR 缓冲液，5x	5 µl
无核酸酶水	10µl
HotStarTaq DNA 聚合酶 (6 U/µl)	1µl
全部的	25µl

表 27. RNA 文库组分通用 PCR 的反应混合物

零件	体积/反应
样品（来自“方案：结合靶向 DNA+RNA 富集单管“，页43)	9 µl
或者
RNA 样本（来自“附录 B：分离的靶向 DNA 和 RNA在单独的管中富集“，页74)
UPCR 缓冲液，5x	5 µl
无核酸酶水	10µl
HotStarTaq DNA 聚合酶 (6U/µl)	1µl
全部的	25µl

3. 至 QIAseq Multimodal S5 板（表 28，表 29，或者表 30)，将 25 µl 用于 DNA 文库通用 PCR 的反应混合物添加到 DNA 孔（第 1-6 列），并将 25 µl 用于 RNA 文库通用 PCR 的反应混合物添加到 QIAseq 的 RNA 孔（7-12 列）多式联运 S5 板。
注意：QIAseq Multimodal S5 板是可切割的板，在单独的孔中包含用于 DNA 和 RNA 样品的预分配、干燥的索引引物。 DNA引物和RNA引物预计成对使用：例如样品1应使用DNA引物SQDIB001和RNA引物SQDIB049，样品2应使用DNA引物SQDIB002和RNA引物SQDIB050等。
注意：如果只使用一个柱子，从可切割板上切下该柱子，然后继续下一步。

表 28. QIAseq Multimodal S5 板的布局，12 个反应

SQDIB001

uDNA Pr

SQDIB009

uDNA Pr

Empty

SQDIB049

uRNA Pr

SQDIB057

uRNA Pr

Empty

SQDIB002

uDNA Pr

S10

SQDIB010

uDNA Pr

Empty

SQDIB050

uRNA Pr

S10

SQDIB058

uRNA Pr

Empty

SQDIB003

uDNA Pr

S11

SQDIB011

uDNA Pr

Empty

SQDIB051

uRNA Pr

S11

SQDIB059

uRNA Pr

Empty

SQDIB004

uDNA Pr

S12

SQDIB012

uDNA Pr

Empty

SQDIB052

uRNA Pr

S12

SQDIB060

uRNA Pr

Empty

SQDIB005

uDNA Pr

Empty

SQDIB0S3

uRNA Pr

Empty

SQDIB006

uDNA Pr

Empty

SQDIB054

uRNA Pr

Empty

SQDIB007

uDNA Pr

Empty

SQDIB055

uRNA Pr

Empty

SQDIB008

uDNA Pr

Empty

SQDIB0S6

uRNA Pr

Empty

表 29. QIAseq Multimodal S5 板的布局，48 次反应 Set A

SQDIB001

uDNA Pr

SQDIB009

uDNA Pr

SQDIB017

S17

uONA Pr

SQDIB025

S25

uDNA Pr

SQDIB033

S33

uDNA Pr

SQDIB041

S41

uDNA Pr

SQDIB049

uRNA Pr

SQDIB057

uRNA Pr

SQDIB065

S17

URNA Pr

SQDIB073

S25

uRNA Pr

SQDIB081

S33

uRNA Pr

SQDIB089

S41

uRNA Pr

SQDIB002

uDNA Pr

SQDIB010

S10

uDNA Pr

SQDIB018

S18

uDNA Pr

SQDIB026

S26

uDNA Pr

SQDIB034

S34

uDNA Pr

SQD1B042

S42

uDNA Pr

SQDIB050

uRNA Pr

SQDIB058

S10

uRNA Pr

SQDIB066

S18

uRNA Pr

SQDIB074

S26

URNA Pr

SQDIB082

S34

uRNA Pr

SQDIB090

S42

uRNA Pr

SQDIB003

uDNA Pr

SQDIB011

S11

uDNA Pr

SQDIB019

S19

uONA Pr

SQDIB027

S27

uDNA Pr

SQDIB035

S35

uDNA Pr

SQDIB043

S43

uDNA Pr

SQDIB051

uRNA Pr

SQDIB059

S11

uRNA Pr

SQDIB067

S19

URNA Pr

SQDIB075

S27

uRNA Pr

SQDIB083

S35

uRNA Pr

SQDIB091

S43

uRNA Pr

SQDIB004

uDNA Pr

SQDIB012

S12

uDNA Pr

SQDIB020

S20

uDNA Pr

SQDIB028

S28

uDNA Pr

SQDIB036

S36

uDNA Pr

SQDIB044

S44

uDNA Pr

SQDIB052

uRNA Pr

SQDIB060

S12

uRNA Pr

SQDIB068

S20

uRNA Pr

SQDIB076

S28

uRNA Pr

SGDIB084

S36

uRNA Pr

SQDIB092

S44

uRNA Pr

SQDIB005

uDNA Pr

SQDIB013

S13

uDNA Pr

SQDIB021

S21

uDNA Pr

SQDIB029

S29

uDNA Pr

SQDIB037

S37

uDNA Pr

SQDIB045

S45

uDNA Pr

SQDIB053

uRNA Pr

SQDIB061

S13

uRNA Pr

SQDIB069

S21

uRNA Pr

SQDIB077

S29

uRNA Pr

SQDIB085

S37

uRNA Pr

SQDIB093

S45

uRNA Pr

SQDIB006

uDNA Pr

SQD1B014

S14

uDNA Pr

SQDIB022

S22

uDNA Pr

SQDIB030

S30

uDNA Pr

SQDIB038

S38

uDNA Pr

SQDIB046

S46

uDNA Pr

SQDIB054

uRNA Pr

SQDIB062

S14

uRNA Pr

SQDIB070

S22

uRNA Pr

SQDIB078

S30

uRNA Pr

SQDIB086

S38

uRNA Pr

SQD1B094

S46

uRNA Pr

SQDIB007

uDNA Pr

SQDIB015

S15

uDNA Pr

SQDIB023

S23

uDNA Pr

SQDIB031

S31

uDNA Pr

SQDIB039

S39

uDNA Pr

SQDIB047

S47

uDNA Pr

SQDIB055

uRNA Pr

SQDIB063

S15

uRNA Pr

SQDIB071

S23

uRNA Pr

SQDIB079

S31

uRNA Pr

SQDIB087

S39

uRNA Pr

SQDIB095

S47

uRNA Pr

SQDIB008

uDNA Pr

S16

SQDIB016

uDNA Pr

S24

SQDIB024

uDNA Pr

S32

SQDIB032

uDNA Pr

S40

SQDIB040

uDNA Pr

S48

SQDIB048

uDNA Pr

SQDIB056

uRNA Pr

S16

SQDIB064

uRNA Pr

S24

SQDIB072

uRNA Pr

S32

SQDIB080

uRNA Pr

S40

SQDIB088

uRNA Pr

SQDIB096

S48

uRNA Pr

表 30. QIAseq Multimodal S5 板的布局，48 次反应 Set B

SQDIB097

S49

uDNA Pr

SQDIB105

S57

uDNA Pr

SQDIB113

S65

uDNA Pr

SQD1B121

S73

uDNA Pr

SQDIB129

S81

uDNA Pr

SQDIB137

S89

uDNA Pr

SQDIB145

S49

uRNAPr

SQDIB153

S57

uRNA Pr

SQDIB161

S65

uRNAPr

SQDIB169

S73

uRNA Pr

SQDIB177

S81

uRNA Pr

SQDIB18!

S89

uRNA Pr

SQDIB098

S50

uDNA Pr

SQDIB106

S58

uDNAPr

SQDIB114

S66

uDNA Pr

SQDIB122

S74

uDNA Pr

SQDIB130

S82

uDNA Pr

SQDIB138

S90

uDNA Pr

SQDIB146

S50

uRNA Pr

SQDIB154

S58

uRNA Pr

SQDIB162

S66

uRNAPr

SQDIB170

S74

uRNA Pr

SQDIB178

S82

uRNA Pr

SQDIB186

S90

uRNA Pi

SQDIB099

S51

uDNA Pr

SQDIB107

S59

uDNAPr

SQDIB115

S67

uDNA Pr

SQDIB123

S75

uDNA Pr

SQDIB131

S83

uDNA Pr

SQDIB139

S91

uDNA Pr

SQDIB147

S51

uRNA Pr

SQDIB155

S59

uRNA Pr

SQDIB163

S67

uRNA Pr

SQDIB17

S75

uRNA Pr

SQDIB179

S83

uRNA Pr

SQDIB187

S91

uRNA Pl

SQDIB100

S52

uDNA Pr

SQDIB108

S60

uDNAPr

SQDIB116

S68

uDNA Pr

SQD1B124

S76

uDNA Pr

SQDIB132

S84

uDNA Pr

SQDIB140

S92

uDNA Pr

SQDIB148

S52

uRNA Pr

SQDIB156

S60

uRNA Pr

SQDIB164

S68

uRNAPr

SQDIB172

S76

uRNA Pr

SQDIB180

S84

uRNA Pr

SQDIB185

S92

uRNA Pi

SQDIB101

S53

uDNA Pr

SQDIB109

S61

uDNA Pr

SQDIB117

S69

uDNA Pr

SQDIB125

S77

uDNA Pr

SQDIB133

S85

uDNA Pr

SQDIB141

S93

uDNA Pr

SQDIB149

S53

uRNA Pr

SQDIB157

S61

uRNA Pr

SQDIB16S

S69

uRNAPr

SQDIB173

S77

uRNA Pr

SQDIB181

S85

uRNA Pr

SQDIB18

S93

uRNA Pl

SQDIB102

S54

uDNA Pr

SQDIB110

S62

uDNAPr

SQDIB118

S70

uDNA Pr

SQDIB126

S78

uDNA Pr

SQDIB134

S86

uDNA Pr

SQDIB142

S94

uDNA Pr

SQDIB150

S54

uRNA Pr

SQDIB158

S62

uRNA Pr

SQDIB166

S70

uRNA Pr

SQDIB174

S78

uRNA Pr

SQDIB182

S86

uRNA Pr

SQDIB19C

S94

uRNA Pl

SQDIB103

S55

uDNA Pr

SQDIB111

S63

uDNAPr

SQDIB119

S71

uDNA Pr

SQDIB127

S79

uDNA Pr

SQDIB135

S87

uDNA Pr

SQDIB143

S95

uDNA Pr

SQDIB151

S55

uRNA Pr

SQDIB159

S63

uRNA Pr

SQDIB167

S71

uRNA Pr

SQDIB175

S79

uRNA Pr

SQDIB183

S87

uRNA Pr

SQDIB191

S95

uRNA Pt

SQDIB104

S58

uDNA Pr

SQDIB112

S64

uDNAPr

SQDIB120

S72

uDNA Pr

SQD1B128

S80

uDNA Pr

SQDIB136

S88

uDNA Pr

SQDIB144

S96

uDNA Pr

SQDIB152

S56

uRNA Pr

SQDIB160

S64

uRNA Pr

SQDIB168

S72

uRNAPr

SQDIB176

S80

uRNA Pr

SQDIB184

S88

uRNA Pr

SQD1B192

S96

uRNA Pi

4. 使用中的循环条件对热循环仪进行编程表 31。

表 31. 通用 PCR 的循环条件

步	时间	温度
抓住	13 分钟	95°C
抓住	2 分钟	98°C
2 步循环
变性	15 s	98°C
退火/延伸	2 分钟	62°C
循环数	基于 ”方案：qPCR 测定通用 PCR 循环数“，页51
抓住	∞	4°C

5. 反应完成后，加入 75 µl 无核酸酶水，使每个样品达到 100 µl。

6. 加入 100 µl QIAseq Beads，然后通过涡旋或上下吹打数次混合。

7. 在室温下孵育 5 分钟。

8. 将管/板放在磁架上 2 分钟（用于管）或 10 分钟（用于板）以将珠子与上清液分离。

9. 溶液澄清后，磁珠仍在磁架上，小心取出并丢弃上清液。
重要提示：不要丢弃磁珠，因为它们含有感兴趣的DNA。

10. 磁珠仍在磁力架上，加入 200 µl 80% 乙醇。旋转管子 2-3 次或在磁铁的 2 个柱位置之间左右移动板以清洗珠子。小心取出并丢弃洗涤液。

11. 重复乙醇洗涤。
重要提示：第二次洗涤后，彻底清除所有乙醇痕迹。首先用 200 µl 移液器吸头除去乙醇，短暂旋转，然后使用 10 µl 移液器吸头除去任何残留的乙醇。

12. 磁珠仍在磁力架上，在室温下风干 5-10 分钟。
注意：目视检查颗粒以确认其完全干燥。如果颗粒没有完全干燥，可能需要额外的干燥时间。

13. 从磁力架上取下磁珠，然后加入 20 µl Nuclease-free Water 从磁珠上洗脱 DNA。通过移液充分混合。

14. 将管/板放回磁架，直到溶液清除。

15. 将 18 µl 上清液转移到干净的试管/板上。

16. 继续 ”建议：文库 QC 和量化“. 或者，可以将样品储存在 –30 至 –15°C 的恒温冰箱中。

9

文库 QC 和量化

NGS 文库质控

QC 可以使用安捷伦生物分析仪或 TapeStation 进行。检查文库片段的大小分布是否正确（约 400–500 bp 中值大小）以及是否缺少接头或接头二聚体（约 <200 bp）（图4）.

图 4. QIAseq 多模式靶向 DNA（左）和靶向 RNA（右）文库。

△点击放大图片

首选文库量化方法

来自 Bioanalyzer 或 TapeStation®的文库产量测量依赖于嵌入 DNA 或 RNA 的荧光染料。这些染料无法区分带有或不带有接头序列的分子，但只有具有完整接头序列的完整 QIAseq Multimodal 文库才会被测序。因此，强烈推荐使用 QIAGEN 的 QIAseq Library Quant Array Kit（货号 333304）或 QIAseq Library Quant Assay Kit（货号 333314），其中包含实验室验证的正向和反向引物以及 DNA 标准品用于对准备好的 QIAseq Multimodal 文库进行准确量化。
10

Illumina MiSeq 和 NextSeq 上的测序设置

开始前的要点
· 关于文库稀释浓度和文库加载浓度的建议基于 QIAseq Library Quant System。

· 在 Illumina 平台上进行测序时，必须使用 QIAseq A Read 1 Primer I（Custom Read 1 Sequencing Primer）和 Multimodal Read 2 Primer（Custom Read 2 Sequencing Primer）。

· QIAseq A Read 1 Primer I（Custom Read 1 Sequencing Primer）进入以下特定试剂盒位置：
· MiSeq 位置 #18
· NextSeq 位置 #7

· Multimodal Read 2 Primer（Custom Read 2 Sequencing Primer）进入以下特定试剂盒位置：
· MiSeq 位置 #20
· NextSeq 位置 #8

· 双端测序应用于 Illumina 平台上的 QIAseq Multimodal 文库。
· 读取 1：149 bp
· 读取 2：149 bp
· 自定义索引 1：10 个基点
· 自定义索引 2：10 个基点

· 有关如何使测序文库变性、准备自定义索引引物和设置测序运行的完整说明，请参阅系统特定的 Illumina 文档。

· 包括特定于仪器的图像以帮助进行测序准备。

MiSeq 的测序准备工作

1.从 QIAseq Multimodal Panel 的“资源”选项卡下载适当的模板：
· 样品表 Multimodal UDI Set A（也用于索引 1-12）：www.qiagen.com/PROM-15281
· 样品表多式联运 UDI 集 B：www.qiagen.com/PROM-15282
· 样品表多式联运 UDI 集 A 和集 B：www.qiagen.com/PROM-15283

2.在模板上：
2a.修改 Investigator Name、Date、Sample_ID 和 Sample Name。
重要提示：我们建议在 DNA 文库的样本名称中添加 -DNA，在 RNA 文库中添加 -RNA，以便在数据分析期间自动解析 DNA 和 RNA 文库。如果文库没有标记，则必须手动将它们解析到 DNA 或 RNA 盒中。
2b.删除任何未使用的索引对并保存样本表以供上传。

2c.Read 1 为 149 bp，Read 2 为 149 bp，每个 Index Read 为 10 bp。

3. 样品稀释和汇集：将文库稀释至 2 或 4 nM，用于 MiSeq。然后，如果每个文库需要相似的测序深度，则以等摩尔量组合具有不同样本索引的文库。
注意：如果将具有相同数量引物的库组合在一起，则将等量的单个库以 4 nM 汇集在一起。如果文库有不同的引物编号，则根据它们的引物数量以体积比组合文库。例如，文库 A 有 5000 个 4 nM 的引物，文库 B 有 600 个 4 nM 的引物；将 50 µl 文库 A 与 6 µl 文库 B 结合起来，在同一次测序运行中，文库 A 和 B 的覆盖深度相似。

4. 文库准备和加载：根据 MiSeq 系统变性和稀释文库指南在 MiSeq 上准备和加载文库。 MiSeq 上的最终库浓度为 10-12 pM。
注意：关于文库加载浓度的建议基于 QIAseq Library Quant System。
（杂交缓冲液）从 Illumina Sequencing Kit 中稀释 3 µl QIAseq A Read 1 Primer I（已提供）以获得 0.5 µM 的最终浓度。将 600 µl 稀释的 QIAseq A Read 1 Primer I 加载到 MiSeq 试剂盒的位置 18（图5）.有关更多详细信息，请参阅 Illumina 的 MiSeq 系统：自定义引物指南。

5. 用于读取 2 制备和加载的定制测序引物：使用 Illumina 测序试剂盒中的 597 µl HT1（杂交缓冲液）稀释 3 µl Multimodal Read 2 Primer（已提供），以获得 0.5 µM 的最终浓度。将 600 µl 稀释的 QIAseq Read 2 Primer 加载到 MiSeq 试剂盒的位置 20（图5）.有关更多详细信息，请参阅 Illumina 的 MiSeq 系统：自定义引物指南。

图 5. MiSeq 试剂盒。 A：Read 1 Custom Primer 的位置 18； C：Read 2 Custom Primer 的位置 20。

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6. 完成测序运行后，继续“操作步骤：数据分析使用 QIAseq 多模态数据分析门户“.

NextSeq 的测序准备工作

1. 样品稀释和汇集：将文库稀释至 0.5、1、2 或 4 nM，用于 NextSeq。然后，如果每个文库需要相似的测序深度，则以等摩尔量组合具有不同样本索引的文库。
注意：文库稀释浓度建议基于 QIAseq Library Quant System。
注意：如果将具有相同数量引物的库组合在一起，则将等量的单个库以 4 nM 汇集在一起。如果文库有不同的引物编号，则根据它们的引物数量以体积比组合文库。例如，文库 A 有 5000 个 4 nM 的引物，文库 B 有 600 个 4 nM 的引物；将 50 µl 文库 A 与 6 µl 文库 B 结合起来，在同一次测序运行中，文库 A 和 B 的覆盖深度相似。

2. 文库准备和加载：根据 NextSeq 系统变性和稀释文库指南准备文库并将其加载到 NextSeq。 NextSeq 上的最终文库浓度为 1.2–1.5 pM。
注意：关于文库加载浓度的建议基于 QIAseq Library Quant System。

3. 用于 Read 1 制备和加载的定制测序引物：使用 Illumina 测序试剂盒中的 1994 µl HT1（杂交缓冲液）稀释 6 µl QIAseq A Read 1 Primer I（已提供），以获得 0.3 µM 的最终浓度。将 2 ml 稀释的 QIAseq A Read 1 Primer I 加载到 NextSeq 试剂盒的位置 7（图6）.

注意：所有其他步骤均参考 NextSeq 500 系统指南（部件号 15046563）或 NextSeq 550 系统指南（部件号 15069765-02）中描述的运行设置工作流程。
Illumina Sequencing Kit 中的（杂交缓冲液）稀释 6 µl Multimodal Read 2 Primer 以获得 0.3 µM 的最终浓度。将 2 ml 稀释的 Multimodal Read 2 Primer 加载到 NextSeq 试剂盒的位置 8（图6）.

图 6. NextSeq 试剂盒。

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4. 使用 QIAseq Multimodal 定制 UDI 时，使用仪器上的 Local Run Manager (LRM) V2 上传样品表（请参阅第 66 页下载适当的模板和修改模板）并继续测序：读取 1 为 149 bp，读取2 为 149 bp，每个 Index Read 为 10 bp。

5. 完成后，继续“操作步骤：使用 QIAseq Multimodal 进行数据分析数据分析门户“.
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使用 QIAseq 多模式数据分析门户进行数据分析

测序后，可以使用 QIAGEN 的 QIAseq Multimodal Data Analysis Portal 分析结果。我们的数据分析管道将执行到参考基因组的映射、UMI 计数、读取修剪（去除引物序列）和变异识别。所有检测到的变体都可以使用 QCI-I 进一步解释。

1. 转到 QIAseq 多模式数据分析门户，ngsdataanalysis2.qiagen.com/MultiModal/

2. 登录门户。

3. 在读取文件选项卡中，选择 BaseSpace 以从 BaseSpace 上传文件，或选择已上传 > 上传新文件以从本地硬盘上传文件。

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注意：已上传到门户的所有文件都列在“读取文件”选项卡下。在这里可以删除不再需要的文件并与协作者共享文件。

4. 选择要分析的文件旁边的框，然后单击选择分析。

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5. 在分析作业选项卡下，按照下拉菜单和复选框配置分析，如下所述：

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· 读取文件：验证是否选择了正确的读取文件。

· 工作标题：输入分析工作的标题。

· 工作类型：选择 DNA 和 RNA、仅 DNA 或仅 RNA。

· 目录编号：如果使用目录面板，请从下拉菜单中选择编号。如果使用自定义面板，请手动输入自定义目录号。

· 文件通道：如果使用 MiSeq/HiSeq/NovaSeq 或 NextSeq 与级联文件一起使用，则选择 1 通道。如果使用 NextSeq 而没有最终连接文件，则选择 4-lane。

· DNA smCounter版本：根据实验选择合适的版本需要。如需指导，请选择信息。

· 拷贝数参考作业 ID：对于拷贝数分析，需要在设置案例样本之前使用门户网站分析正常样本。输入与您的对照样本对应的作业 ID 以进行拷贝数分析。

· RNAscan 分析模式：选择 Fusion Calling 和/或 SNP/Indel Variant Calling。默认情况下，每个选择都提供基因表达分析。

6. 单击匹配 DNA RNA 文件以手动将选定的读取文件拖到 DNA 文件框或 RNA 文件框。
注意：我们建议您在 DNA 文库的样本名称末尾包含 -DNA，在 RNA 文库中包含 -RNA，以便在数据分析期间自动解析 DNA 和 RNA 文库。

7. 单击分析。分析作业状态从“Queued”变为“In progress”，然后变为“Done successful”。

8. 分析完成后，可以通过单击下载来下载输出文件。

注意：最终，检测到的变异可以用 QCI-I 解释。

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