视频素材来源于YouTube https://www.youtube.com/watch?v=c-f1H07D_70
版权归原作者所有
最佳的引物序列和适当的引物浓度对于PCR的最大特异性和效率至关重要。
实验步骤
- 1
- 2
- 3
- 4
-
引物的设计和使用指南
Standard PCR Multiplex PCR One-step RT-PCR 长度 18–30nt 21–30nt 18–30nt GC含量 40–60% 40–60% 40–60% Tm信息 所有引物对的Tm应一致 所有引物对的Tm应一致。为了获得最佳结果，Tm应为60–88°C 所有引物对的Tm应一致。Tm不应低于逆转录的温度（例如，50°C） 最优退火温度 低于Tm 5°C 低于Tm 5–8°C（当＞68°C时）或低于Tm 3–6°C（当60–67°C时） 低于Tm 5°C 引物位置 – – 为了防止gDNA的检测：引物与一个外显子的3端和相邻外显子5端杂交。或者，引物与包含至少一个内含子的侧翼区域杂交。如果只知道信使核糖核酸序列，则选择相距300–400个碱基的引物退火位点。 起始浓度 20–30µg 20–30µg 20–30µg -
PCR引物的摩尔转化率
Primer length pmol/µg 20pmol 18mer 168 119ng 20mer 152 132ng 25mer 121 165ng 30mer 101 198ng -
设计PCR引物时应考虑以下几点，这些点对所有类型的PCR都是常见的
Tm计算：2℃*(A+T)+4℃*(G+C)
避免引物对3'末端的2～3个碱基互补
避免引物3'端与模板不匹配
避免引物内部和引物对之间的互补性
避免在3'端使用T作为最终碱基
确保引物序列对于模板序列是唯一的
每种引物的使用浓度为0.1–1.0µM。对于大部分应用，0.2µM的引物浓度就足够了； -
冷冻引物应溶解在少量蒸馏水或TE中，制成浓缩储备溶液。
准备含有10pmol/µl的小份工作溶液，以避免重复解冻和冷冻。将所有引物溶液储存在-20°C温度下。引物质量可以在变性聚丙烯酰胺凝胶上进行检查；应该看到单个条带。