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Taq酶具有5'-3'DNA聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性，缺少3'→5'的外切酶活性因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。而高保真酶具有极强的校对功能，其保真度比Taq酶高50倍，远高于其他同类酶,适用于质粒构建等。本流程以2× Xerox PCR Master Mix(货号： abs60034)为例：
实验步骤
- 1
- 2
-
PCR扩增体系
实际操作中应该首先计算需补加水的体积，先加水，然后按下表中所列顺序添加其他成分。充分混匀后，离心数秒使反应混合物沉到管底，将反应管置于PCR仪中进行扩增；
组分
体积
终浓度
Nuclease-FreeWater
Add to 25μl
2× Xerox PCR Master Mix
12.5μl
1×
10µM Forward Primer
0.5-1μl
0.2-0.4μM
10µM Reverse Primer
0.5-1μl
0.2-0.4μM
Template DNA
variable
<1,000ng
-
PCR 循环设置
Cycle step
Temperature
Time
Cycles
预变形
98℃
1—3min
1
变性
退火
延伸
98℃
50-72℃
72℃
5-10sec
10-20sec
10-30sec/kb
25-40
终延伸
72℃
4℃
5 min
Hold
1
※Xerox DNA聚合酶的最佳延伸温度是72℃。延伸所需要的时间依赖于扩增产物的长度和复杂度。对于质粒，BAC这类简单模板，可以使用15sec/kb延伸速度，对于高复杂性的基因组DNA，可以使用30sec/kb延伸速度。扩增1kb以下的产物时，延伸时间不要超过40sec。