要使用RNA作为起始模板进行PCR，必须首先在逆转录(RT)反应中将RNA逆转录为cDNA。RT和PCR可以在同一管中依次进行(一步RT-PCR)或分别进行(两步RT-PCR)。步骤货号：210212：
实验步骤
- 1
- 2
- 3
- 4
- 5
- 6
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混合样本和试剂
将模板RNA，引物，dNTP混合液，5× QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer，无RNA酶水以及 5×Q-Solution(可选)解冻并置于冰上。使用前混合均匀；
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根据下表准备反应混合液
此混合液包含了除模板RNA外所有反应需要的成分。在准备反应混合液时为了应对移液枪吸头黏附液体的误差，请在总量基础上再多准备10%。
组分
体积/反应
终浓度
反应混合液
QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer,5×
10 μl
1×; 2.5 mM Mg2+
dNTP混合液（每种10 mM）
2 μl
每种dNTP 400 μM
引物A
可变
0.6 μM
引物B
可变
0.6 μM
无RNA酶水
可变
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QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix
2 μl
可选：5× Q-Solution*
10 μl
1×
可选：RNA酶抑制剂（需自备）
可变
每反应5-10单位
模板RNA
可变
总反应体积
50 μl
每反应1pg -2μg
注：每个实验都必须包括一个阴性对照(不加模板RNA)
*富含GC或有复杂二级结构模板用
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混匀反应液体，并分装
轻轻吹打反应混合液数次以彻底混匀，将适当体积的反应液分装至PCR反应管；
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模板RNA（每个反应不要超过2μg）
本试剂盒适用于总RNA，信使RNA(mRNA)以及病毒RNA等；
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按下表条件设置热循环仪
这个流程中反转录和PCR反应条件在大部分反应中都能得到满意的结果。如果希望得到最大的PCR产量及特异性，针对每个新的模板—引物体系都应该对温度和循环次数进行优化；
步骤
时间
温度
注释
反转录反应
30min
50 °C
如果50 °C反应结果不佳，可提高反应温度，最高不超过60 °C
PCR初始激活
15min
95°C
此热激活步骤可激活热启动Taq DNA聚合酶，并使反转录酶失活，同时也能使cDNA模板变性。
三步法循环变性
0.5-1min
94°C
勿超过此温度
退火
0.5-1min
50-68°C
大约比引物Tm低5°C
延伸
1min
72 °C
对于长度为1-2 kb的RT-PCR产物可将延伸时间增加30-60 s
循环次数
25-40
最佳循环数取决于模板RNA的丰度
最后延伸
10min
72 °C
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设置热循环程序
开始运行设定好的热循环程序，待热循环仪达到50°C后将PCR管从冰上转移到热循环仪内。