荧光染料SYBR Green I结合所有双链DNA分子，在结合时发出特定波长的荧光信号(见图SYBR Green原理)。
SYBR Green I的激发和发射最大值分别在494nm和521nm，允许使用任何实时循环仪的染料。检测在实时PCR的扩展步骤中进行。由于PCR产物的积累，信号强度随着循环次数的增加而增加。使用SYBR Green能够分析许多不同的靶标，而不必合成靶标特异性标记的探针。然而，非特异性PCR产物和引物－二聚体也会对荧光信号做出贡献。因此，当使用SYBR Green时，需要高的PCR特异性。
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本流程以QIAGEN的QuantiNova SYBR Green PCR Kit(货号：208054)为例：
实验步骤
- 1
- 2
- 3
- 4
- 5
- 6
-
制作反应体系
将2x QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix、QuantiNova Yellow Template Dilution Buffer、模板gDNA或cDNA、引物、QN ROX Reference Dye(根据需要)以及RNase-Free水解冻并混匀，根据下表制备反应混合液。由于存在热启动机制，构建反映或设置实时定量PCR仪时，不必将样品一直放在冰上；
PCR体系构建
组分
体积/反应
96孔模块
384孔模块
终浓度
2x QuantiNova SYBR Green PCR Kit
10ul
5ul
1x
QN ROX Reference Dye（仅需要时）
2ul/0.1ul
1ul/0.05ul
1x
引物A
可变
可变
0.7uM
引物B
可变
可变
0.7uM
RNase-Free水
可变
可变
模板DNA或cDNA
可变
可变
≤100ug/次反应
总反应体积
20ul
10ul
-
混匀反应混合物
充分混匀反应混合物，并取适当体积加入PCR管或反应板中；
-
加样
将模板gDNA或cDNA(≤100ng/次反应)加入含有反应混合液的各个PCR管或孔中。对于两步法积的10%。RT-PCR，加入的cDNA(来自未稀释的反转录反应物)体积不能超过PCR终体积；
-
根据下表中列出的程序设置实时定量PCR仪
根据下表中列出的程序设置实时定量PCR仪。 应在进行退火/延伸步骤时收集数据。
实时定量PCR仪反应条件
步骤
时间
温度
升降温速率
补充说明
PCR热启动步骤
2min
95℃
最大/快速模式
QuantiNova DNA
Polymerase 经此加热步骤活化两步循环
变性
5s
95℃
最大/快速模式
退火/延伸步骤
10s☆
60℃↑
最大/快速模式
收集荧光数据
循环次数35-40∞
循环数取决于模板DNA的量
熔解曲线分析&
☆ 如果PCR仪无法在这么短的时间内完成数据采集，则以仪器采集数据所需的最短时间为准
↑ 该温度也同样适用于所有Tm低于60℃的引物对
∞ 循环数取决于模板DNA的量
& 熔解曲线分析是实时定量PCR仪软件内置的一项分析步骤。进行此分析时，须遵守仪器提供的说明 -
启动PCR仪器
将PCR管或反应板放置在实时定量PCR仪上并启动PCR程序；
-
对 PCR 产物进行熔解曲线分析
此项分析功能已内置于实时定量PCR仪的软件中，我们强烈建议您定期进行此项分析以验证PCR产物的特异性。